發(fā)布時間：2017-12-11 13:28

  本文關(guān)鍵詞：抗停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的表位疫苗構(gòu)建及免疫原性評價

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【摘要】：奶牛乳房炎主要是由病原微生物引起的奶牛乳腺炎癥,給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。引起奶牛乳房炎的病原菌眾多,其中以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和鏈球菌引起的奶牛乳房炎最為常見。目前,臨床抗生素療法無法控制金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染,疫苗研制迫在眉睫。研究證明,在預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染過程中細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮主要作用,尤其在預(yù)防金黃色葡萄球菌感染中以Th1和Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答為主,因而啟動CD4~+T細(xì)胞應(yīng)答對于設(shè)計有效預(yù)防奶牛乳房炎疫苗至關(guān)重要�？乖�誘導(dǎo)免疫應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用的部分是抗原表位,因此構(gòu)建能夠啟動CD4~+T細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為Th1/Th7類型免疫應(yīng)答的表位疫苗可能會有效預(yù)防鏈球菌和金黃色葡萄球菌的感染。停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae,S.dysgalactiae)GapC和金黃色葡萄球菌TRAP蛋白能夠誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答且高度保守,而GapC和TRAP的CD4~+T細(xì)胞表位未見報道,對于包含停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的CD4~+T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的表位疫苗也未見報道。因此,本研究首先對GapC和TRAP的CD4~+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位進(jìn)行篩選,構(gòu)建涵蓋GapC和TRAP的免疫優(yōu)勢CD4~+T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的多表位疫苗,以期獲得一種能夠同時有效預(yù)防鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的新型疫苗。本研究通過預(yù)測GapC和TRAP蛋白與MHCⅡ的親和力,結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及其保守序列分析篩選并分別合成6個GapC(15-mer)和5個TRAP(20-mer)的候選表位肽,分別以候選表位刺激免疫蛋白或表位的BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠的CD4~+T細(xì)胞,檢測CD4~+T細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞因子分泌水平,并對鑒定表位的保守性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)能夠誘導(dǎo)特異性的CD4~+T細(xì)胞增值,同時分泌了高水平的IFN-γ和IL-17A,與PBS免疫組之間存在極顯著差異,表明鑒定的表位主要引起Th1和Th17型免疫反應(yīng),證實GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP(94-113)分別為GapC和TRAP的CD4~+T細(xì)胞表位,且鑒定表位高度保守。在上述研究基礎(chǔ)上,將獲得的CD4~+T細(xì)胞表位GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)分別與實驗室前期鑒定的B細(xì)胞表位GapC_(30-36)、GapC_(48-57)、GapC_(97-103)和TRAP_(154-163)進(jìn)行串聯(lián),并將氨基酸序列對應(yīng)的目標(biāo)基因進(jìn)行合成,將目標(biāo)基因插入pET32a載體中,構(gòu)建含有多個表位的重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白,制備重組表位疫苗PT、PG和PTG。將構(gòu)建的表位疫苗免疫BALB/c和C57BL/6小鼠后進(jìn)行免疫原性分析。通過淋巴細(xì)胞增殖試驗、細(xì)胞因子的檢測評價表位疫苗的細(xì)胞免疫效果;通過抗體水平檢測、調(diào)理吞噬試驗評價表位疫苗的體液免疫效果;通過攻毒試驗評價表位疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示:表位疫苗PT、PG和PTG能夠誘導(dǎo)特異性的淋巴細(xì)胞增值,同時,特異性淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A水平顯著高于pET32a對照組,說明表位疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答;表位疫苗PT、PG和PTG產(chǎn)生的抗TRAP和GapC的IgG抗體水平顯著高于pET32a對照組,且特異性抗體對于停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌具有一定的調(diào)理吞噬作用,說明表位疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答;攻毒實驗結(jié)果顯示表位疫苗PT、PG和PTG具有良好的免疫保護(hù)效果,其中表位疫苗PT能夠較好的抑制金黃色葡萄球菌感染,而PG能夠部分抑制停乳鏈球菌感染,PTG能夠部分抑制停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的感染。上述結(jié)果表明,構(gòu)建的表位疫苗使包含的CD4~+T細(xì)胞表位及B細(xì)胞表位各自發(fā)揮功能,可為奶牛乳房炎疫苗的深入研究提供參考。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23

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本文編號：1278640