發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 15:17

  本文關(guān)鍵詞：BVDV感染細(xì)胞小RNA文庫(kù)的構(gòu)建及miR-2904調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬的研究

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【摘要】：牛病毒性腹瀉病是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea Virus,BVDV)引起的接觸性傳染病,主要引起牛的高熱、腹瀉、白細(xì)胞減少、免疫抑制、黏膜充血等臨床癥狀。目前影響B(tài)VDV持續(xù)性感染防治的關(guān)鍵因素在于對(duì)BVDV持續(xù)性感染形成和維持機(jī)制等的重大基礎(chǔ)理論問題缺乏深入系統(tǒng)的認(rèn)識(shí),BVDV持續(xù)性感染形成和維持的關(guān)鍵在靶細(xì)胞和機(jī)體兩個(gè)水平。大量研究表明microRNA(mi RNA)在病原體與宿主細(xì)胞相互作用中發(fā)揮重要作用,因此,在本研究中將重點(diǎn)從病毒感染細(xì)胞后,miRNA調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬以及免疫角度來揭示BVDV持續(xù)感染的機(jī)制。目的:通過BVDV感染細(xì)胞過程中小RNA分子對(duì)細(xì)胞凋亡、自噬及對(duì)BVDV復(fù)制的影響,探討B(tài)VDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制。方法:(1)提取正常的MDBK細(xì)胞(MDBKCs)和cpBVDV NADL侵染細(xì)胞(BMDBKCs)兩個(gè)樣品的總RNA構(gòu)建兩個(gè)樣品的miRNA和mRNA文庫(kù),并通過生物信息學(xué)分析軟件對(duì)測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和驗(yàn)證;(2)將合成的miR-2904寡核苷酸轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中,并分別利用倒置顯微鏡、Hoechst染色和流式細(xì)胞儀對(duì)MDBK細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè);并預(yù)測(cè)和鑒定miR-2904在凋亡信號(hào)通路中靶基因caspase-9;檢測(cè)miR-2904寡核苷酸轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平;(3)將cpBVDV NADL感染MDBK細(xì)胞后,并利用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的自噬情況;構(gòu)建的GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDBK細(xì)胞中,并分別將GFP-LC3質(zhì)粒和miR-2904mimics/inhibitor/NC mimics共轉(zhuǎn)染至MDBK細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞的自噬水平則通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè);并預(yù)測(cè)和鑒定miR-2904在自噬信號(hào)通路中靶基因ATG13;檢測(cè)miR-2904寡核苷酸轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后ATG13 mRNA和蛋白表達(dá)水平;(4)用cpBVDV NADL感染MDBK細(xì)胞后,檢測(cè)免疫相關(guān)因子IL-6、IL-1β和IFN-a mRNA水平;并預(yù)測(cè)和鑒定miR-2904在免疫信號(hào)通路中靶基因IL6R;檢測(cè)miR-2904寡核苷酸轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后IL6R mRNA表達(dá)水平;檢測(cè)miR-2904寡核苷酸轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后cp BVDV NADL復(fù)制水平的變化。結(jié)果:(1)在小RNA測(cè)序中,在的對(duì)照組(ck)、2 h、6 h和18 h中分別鑒定出290、280、287和298個(gè)保守的miRNA以及1042、231、354和775個(gè)新的miRNA,在ck-vs-2 h、ck-vs-6 h和ck-vs-18 h中分別鑒定出283、84和54個(gè)顯著差異的已知miRNA,其中有18個(gè)差異表達(dá)的miRNAs在不同時(shí)間段都有表達(dá);高通量測(cè)序的結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果基本保持一致;在RNA-seq測(cè)序中,鑒定出ck-vs-2 h有232個(gè)差異表達(dá)的基因,ck-vs-6h中有135個(gè)差異表達(dá)的基因,ck-vs-18 h中有185個(gè)差異表達(dá)的基因,其中有43個(gè)差異表達(dá)的基因在不同時(shí)間段都有表達(dá);miR-2904能夠抑制cpBVDV NADL的復(fù)制;預(yù)測(cè)miR-2904凋亡、自噬和免疫相關(guān)的靶基因分別有11、6和34個(gè);(2)miR-2904降低了MDBK細(xì)胞的凋亡率;miR-2904能直接靶向caspase-9 3’UTR并抑制其表達(dá);(3)cpBVDV NADL感染增加自噬體/自噬溶酶體數(shù)量;轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,胞漿呈現(xiàn)GFP-LC3融合蛋白;共轉(zhuǎn)GFP-LC3和miR-2904 mimics顯著性降低GFP-LC3陽性細(xì)胞的數(shù)量;miR-2904能直接靶向ATG13 3’UTR并抑制其表達(dá);(4)cpBVDV NADL感染MDBK細(xì)胞后著性增加了IL-6、IL-1β和IFN-a mRNA水平;miR-2904能直接靶向IL6R 3’UTR并抑制其表達(dá);miR-2904過表達(dá)不同程度的降低cpBVDV NADL的復(fù)制水平。結(jié)論:成功構(gòu)建了BVDV感染細(xì)胞的miRNA和mRNA文庫(kù),獲得了一批差異顯著的miRNAs,其中,miR-2904能顯著抑制BVDV的復(fù)制,其影響病毒復(fù)制的可能機(jī)制是miR-2904通過靶向靶基因抑制細(xì)胞的凋亡與自噬,進(jìn)而影響B(tài)VDV的復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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1 穆楊,李健強(qiáng);牛場(chǎng)中BVDV的基因簇:直接從牛血清中進(jìn)行病毒的基因鑒定和分析[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2000年02期

2 郜玉鋼;李t犵，

本文編號(hào)：1278935