發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 23:11

  本文關(guān)鍵詞：兩種中國原產(chǎn)百合體細(xì)胞胚發(fā)生及miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)初步解析

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【摘要】：百合是世界著名球根花卉,具有較高的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和食用價(jià)值。目前我國在百合生產(chǎn)上還存在許多問題,如種球尚未實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化,國內(nèi)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種尚少,種質(zhì)保存方面存在很大困難,大量珍貴野生資源瀕臨滅絕等。體細(xì)胞胚發(fā)生對于百合種質(zhì)保存、遺傳性狀改良、種球繁育等領(lǐng)域具有重要意義,但目前有關(guān)百合體細(xì)胞胚發(fā)生的研究主要集中在植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基篩選等,尚未涉及相關(guān)機(jī)制探索研究,僅有少數(shù)百合成功獲得體細(xì)胞胚但尚不能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。研究表明,miRNA對植物體細(xì)胞胚發(fā)生中涉及的龐大基因網(wǎng)絡(luò)起重要的調(diào)控作用,但miRNA介導(dǎo)植物體細(xì)胞胚發(fā)生的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究旨在構(gòu)建百合體細(xì)胞胚發(fā)生小RNA庫,篩選并挖掘百合體細(xì)胞胚發(fā)生中關(guān)鍵miRNA,為明確百合體細(xì)胞胚發(fā)生miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),闡明miRNA介導(dǎo)百合體細(xì)胞胚發(fā)生的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.成功誘導(dǎo)細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生,并對兩種百合體細(xì)胞胚進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)鑒定和碳水化合物含量測定。試驗(yàn)結(jié)果表明:以兩種百合無菌苗鱗片為外植體,誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-1毒莠定(picloram)+0.2mg·L-1萘乙酸(NAA),細(xì)葉百合和蘭州百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)率分別達(dá)100%和76.7%,兩種百合單個(gè)無菌苗鱗片可分別獲得11個(gè)和6個(gè)體細(xì)胞胚。組織形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明,胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上有明顯差異,胚性細(xì)胞核大、質(zhì)濃且富集了大量淀粉粒,而非胚性細(xì)胞則由細(xì)胞核不明顯的薄壁細(xì)胞構(gòu)成;百合體細(xì)胞胚發(fā)育存在外起源和內(nèi)起源兩類方式,其中外起源方式的球形胚起源于外表層或亞表層細(xì)胞,而內(nèi)起源方式的球形胚均起源于內(nèi)層細(xì)胞,但在隨后發(fā)育中分為始終包埋于內(nèi)層細(xì)胞、突破內(nèi)層細(xì)胞或突破外表層細(xì)胞3種方式;表皮原細(xì)胞、兩極分化和胚柄類似結(jié)構(gòu)等指示因子的出現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了百合體細(xì)胞胚發(fā)生途徑。兩種百合不同階段胚性培養(yǎng)物淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖和可溶性蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果表明,百合體細(xì)胞胚發(fā)生伴隨活躍的碳水化合物代謝。2.構(gòu)建了細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生cDNA文庫,分別獲得66,422和35,450條Unigene,其中細(xì)葉百合和蘭州百合中分別有47,900條和28,573條Unigene獲得GO注釋,兩種百合中共總結(jié)發(fā)現(xiàn)42條與胚發(fā)生相關(guān)的GO類別,涉及Unigene數(shù)量最多的為種子休眠過程中胚發(fā)育終止、根發(fā)育、胚發(fā)育、胚囊發(fā)育和種子萌發(fā)。經(jīng)與KEGG數(shù)據(jù)庫比對,細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生分別涉及341和319條KEGG代謝通路,其中涉及Unigene數(shù)量較多的為核糖體加工、碳代謝、氨基酸合成、淀粉-蔗糖代謝和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等。3.構(gòu)建了細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生小RNA庫,分別比對獲得2,378,760和1,727,322條sRNA,序列長度以24nt所占比例最多,各樣品間以子葉形胚時(shí)期sRNA最活躍。經(jīng)與miRBase數(shù)據(jù)庫比對,細(xì)葉百合中共鑒定得到分屬于超過86個(gè)家族的452個(gè)已知miRNA,蘭州百合中鑒定得到314個(gè)已知miRNA,分屬于超過47個(gè)miRNA家族。其中兩種百合均以miR159家族包括的成員個(gè)數(shù)最多,且該miRNA家族表達(dá)豐度最高。將百合中miRNA家族與24種陸生植物同源序列比對,兩種百合miRNA家族保守性均分為高度保守、中度保守、低度保守和特異性四個(gè)等級。細(xì)葉百合和蘭州百合中分別有389和273個(gè)已知miRNA預(yù)測到相應(yīng)靶基因,且miRNA和靶基因?qū)��?yīng)關(guān)系較為復(fù)雜。此外,兩種百合靶基因GO和KEGG富集結(jié)果顯著不同。4.以兩種百合體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段胚性培養(yǎng)物為試材,以17個(gè)miRNA、2個(gè)snRNAs、1個(gè)rRNA和3個(gè)常用內(nèi)參基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因,經(jīng)過geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder等4款內(nèi)參基因分析軟件綜合評價(jià)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,篩選獲得百合體細(xì)胞胚發(fā)生中miRNA熒光定量表達(dá)檢測的最適內(nèi)參。試驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)葉百合體細(xì)胞胚發(fā)生中,以miR159a為最適內(nèi)參基因,其次為miR408b,而U6為表達(dá)穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因;對蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生而言,FP表達(dá)穩(wěn)定性優(yōu)于一半以上miRNA候選內(nèi)參基因,但仍以miR162表達(dá)穩(wěn)定性最佳,其次為miR159a。最后以miR156和miR529表達(dá)模式分析驗(yàn)證兩種百合候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。兩種百合體細(xì)胞胚發(fā)生中,與蛋白編碼基因和snRNA、rRNA等傳統(tǒng)內(nèi)參基因相比,候選miRNA內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性更優(yōu)越,且同屬不同種的百合中最適內(nèi)參基因不同。5.篩選了兩種百合體細(xì)胞胚發(fā)生中差異表達(dá)的miRNA,并對部分差異miRNA及其靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)合靶基因注釋對差異miRNA和靶基因參與百合體細(xì)胞胚發(fā)生的功能進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明,細(xì)葉百合和蘭州百合中篩選的24個(gè)miRNA和12個(gè)靶基因表達(dá)模式復(fù)雜多變,miRNA和靶基因表達(dá)模式呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)性。其中細(xì)葉百合miR394a和miR528a分別對應(yīng)BGA6和SSG可能參與碳水化合物代謝,蘭州百合miR167、miR397和miR408分別負(fù)調(diào)控WRKY、LAC參與調(diào)控胚性細(xì)胞細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁木質(zhì)素合成,兩種百合miR395和miR396均分別對應(yīng)調(diào)控FtsZ和GRF參與胚性愈傷組織和子葉形胚形成。差異miRNA和靶基因表達(dá)模式的分析是構(gòu)建百合體細(xì)胞胚發(fā)生miRNA-靶基因復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的必要前提,為闡釋miRNA相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。綜上,本研究成功誘導(dǎo)了細(xì)葉百合和蘭州百合體細(xì)胞胚發(fā)生,基于組織形態(tài)學(xué)觀察和碳水化合物含量測定總結(jié)了兩種百合體細(xì)胞胚發(fā)育形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和碳水化合物變化規(guī)律,借助高通量測序技術(shù),挖掘大量與百合體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)的miRNA及靶基因,定量檢測了差異miRNA和靶基因表達(dá)模式,為揭示miRNA介導(dǎo)百合體細(xì)胞胚發(fā)生的機(jī)制提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S682.29
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本文編號(hào)：1280269