發(fā)布時(shí)間：2017-12-12 13:16

  本文關(guān)鍵詞：表達(dá)Anhinga株HN基因嵌合病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤效果的研究

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【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒,屬副粘病毒科、禽副粘病毒屬。19世紀(jì)20年代,有研究報(bào)道NDV能殺傷腫瘤細(xì)胞,1964年,NDV首次被用于癌癥的治療,從此NDV作為一種潛在的腫瘤治療生物制劑引起了人們的關(guān)注,成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。根據(jù)該病毒對(duì)易感動(dòng)物雞的致病力將NDV分為強(qiáng)毒株、中毒株和弱毒株。強(qiáng)毒株溶瘤效果好,但對(duì)生態(tài)造成威脅,影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展;弱毒株對(duì)生物環(huán)境友好,對(duì)家禽沒(méi)有致病作用,但溶瘤效果較差。選擇什么樣的毒株作為腫瘤治療制劑一直是該研究領(lǐng)域難以決定的重大問(wèn)題。最理想的選擇是提高弱毒株的溶瘤效果,而不改變病毒的毒力。以往的研究表明NDV的F基因是決定病毒溶瘤效果的關(guān)鍵基因,但是F基因的溶瘤效果與病毒的毒力密切相關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,當(dāng)使用強(qiáng)毒株的F基因替換弱毒株的F基因時(shí),NDV溶瘤活性增加,但是同時(shí)受體病毒的毒力大幅度提高,甚至可以達(dá)到強(qiáng)毒株的毒力。這些結(jié)果排除了用F基因提高弱毒株溶瘤效果的可能性。最近美國(guó)東南禽病研究所Qingzhong Yu團(tuán)隊(duì)報(bào)道了NDV Anhinga毒株的HN基因的突變顯著提高了該病毒形成合胞體的能力,說(shuō)明除F基因外,HN基因可能也是決定病毒溶瘤效果的重要因素。NDV的HN蛋白是一個(gè)多功能蛋白,其在病毒的感染過(guò)程中扮演著十分重要的角色。HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性,可以識(shí)別細(xì)胞表面的唾液酸受體從而促進(jìn)F蛋白的融合作用。但是,HN基因引起溶瘤效果與病毒致病力的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在用中毒Anhinga的HN基因替換弱毒株Clone30的HN基因,觀察是否能提高弱毒株的溶瘤效果、如能提高弱毒株的溶瘤效果,是否增加弱毒株的對(duì)易感動(dòng)物的致病力,為研制安全、有效(即提高NDV的溶瘤效果,而保持弱毒株的安全性)的溶瘤病毒制劑奠定理論基礎(chǔ)。為了在DNA水平置換中毒株Anhinga的HN基因,本研究首先應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)克隆弱毒株Clone30的全長(zhǎng)基因組。采取了“分段克隆”的策略。在構(gòu)建c DNA克隆時(shí),將NDV Clone30全基因組分成部分重疊的十個(gè)片段,利用重疊部分的酶切位點(diǎn)將這十個(gè)片段依次克隆到低拷貝質(zhì)粒PFLC中,并在基因組3523bp、12357bp位置上進(jìn)行定點(diǎn)突變,作為分子標(biāo)簽用于鑒定拯救出的病毒。本實(shí)驗(yàn)采取的是不依賴(lài)于輔助病毒的完全質(zhì)粒操作系統(tǒng),并使用穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的BHK-21細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。拯救獲得的重組病毒通過(guò)雞胚進(jìn)行增殖并收集尿囊液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),重組病毒命名為新城疫r Clone30。然后用中毒株Anhinga(Anh)的HN基因替換了弱毒株Clone30的HN基因,構(gòu)建了重組嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。首先將HN基因的PCR產(chǎn)物亞克隆入感染性克隆p Clone30載體,與輔助質(zhì)粒NP、P和L共同轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,37°C培養(yǎng)72h后,于-80°C凍融三次收取細(xì)胞上清,接種9-11日齡的SPF雞胚。繼續(xù)培養(yǎng)72h后,收獲得雞胚尿囊液,即為嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。對(duì)嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的生物學(xué)特性分析顯示,嵌合病毒和親本毒株具有相同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn),即HN基因的替換并沒(méi)有影響Clone30的復(fù)制。嵌合病毒的HA效價(jià)(24)低于親本毒株Clone30(29)與供體株Anh相似(24)。同時(shí),與親本毒株相比嵌合病毒在引起細(xì)胞融合的能力上明顯增強(qiáng),表現(xiàn)在嵌合病毒感染的HepG2細(xì)胞單層中產(chǎn)生較大的合胞體。對(duì)嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)的毒力和致病力分析顯示,r Clone30-Anh(HN)與親本毒株在半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50=3.95×107)、平均死亡時(shí)間(MDT120h)和雞胚半數(shù)感染量(EID50=1.8×108)上沒(méi)有顯著區(qū)別。嵌合病毒腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為0.08略高于親本毒株(ICPI=0),但仍屬于弱毒株(ICPI=0-0.5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HN基因的替換沒(méi)有對(duì)Clone30毒力和致病力造成明顯的影響。在細(xì)胞水平上,對(duì)嵌合病毒rClone30-Anh(HN)抑制腫瘤能力進(jìn)行分析。MTT結(jié)果顯示與親本毒株相比,rClone30-Anh(HN)表現(xiàn)出對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2更為顯著的細(xì)胞毒性作用。通過(guò)對(duì)兩種病毒感染的Hep G2細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV-PI檢測(cè)、Rhodamine123染色和Caspase3基因轉(zhuǎn)錄水平分析,結(jié)果表明HN基因的替換顯著提高了嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。利用兩種病毒對(duì)鼠源肝癌H22荷瘤小鼠進(jìn)行治療,結(jié)果表明與親本毒株相比r Clone30-Anh(HN)治療組的小鼠腫瘤體積明顯縮小,腫瘤病理切片顯示該治療組的腫瘤內(nèi)出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的T細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。實(shí)驗(yàn)證明HN基因的替換提高了Clone30株在體內(nèi)的抑瘤效果。綜上所述,本研究構(gòu)建了表達(dá)中毒株Anhinga的HN基因的重組弱毒株Clone30嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。該嵌合病毒在毒力和致病性與親本毒株相似,但顯著提高了嵌合病毒的抑瘤活性。這些結(jié)果為研制溶瘤效果好,致病力低,安全有效的溶瘤病毒提供了一個(gè)嶄新的思路。同時(shí)得到的嵌合病毒rClone30-Anh(HN)有望取代親本病毒Clone30株,成為新一代溶瘤病毒載體應(yīng)用于腫瘤的治療。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65;R73-36

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1282626