發(fā)布時(shí)間：2017-12-13 10:28

  本文關(guān)鍵詞：無乳鏈球菌三個表面蛋白的重組截短表達(dá)及對羅非魚和大菱鲆的免疫效果

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【摘要】：曾被認(rèn)為是牛乳腺炎和新生兒重要病原菌的無乳鏈球菌(Stepatococcus agalactiae),近年來卻引起了世界各地多種魚類的爆發(fā)性感染和死亡,且無乳鏈球菌存在種間交叉?zhèn)鞑ズ腿?獸-魚共患的危險(xiǎn);而人類對魚類的消費(fèi),也顯著增加了人類受Ia和Ib血清型無乳鏈球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。自2004年起,中國已成為世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖國家,其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的1/3。然而鏈球菌病嚴(yán)重影響我國羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自2009年起,無乳鏈球菌已替代海豚鏈球菌(S.iniae)成為我國以羅非魚為代表的魚類鏈球菌病的首要致病菌,羅非魚發(fā)病規(guī)格更呈小型化趨勢,傳播區(qū)域日漸擴(kuò)散。近年來,新增的受感染種類亦時(shí)有報(bào)道,一些冷水性魚類、海水魚類均有發(fā)病,防控不當(dāng)將累及我國大部分魚類生產(chǎn)企業(yè)。大菱鲆(Scophthalmus maximus)是重要的商業(yè)海水養(yǎng)殖魚類,山東半島為中國大菱鲆主產(chǎn)區(qū),近年來也有多起無乳鏈球菌感染致突眼病的現(xiàn)象,危害大菱鲆養(yǎng)殖業(yè),但目前尚無大菱鲆抗無乳鏈球菌的疫苗研究報(bào)道。疫苗是預(yù)防鏈球菌病的有效手段。然而,無乳鏈球菌共有10種血清型,滅活疫苗特異性強(qiáng),針對某一血清型制備的滅活疫苗對異種血清型菌株無交叉免疫作用,故使用范圍受到極大限制;減毒活疫苗也存在安全性和免疫效力等問題,因此尋求安全、穩(wěn)定、高效的無乳鏈球菌疫苗已成為人類醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn),對人類健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共安全具有重要意義。已有學(xué)者利用生物信息學(xué)方法比對分析人、牛和魚源無乳鏈球菌基因組,預(yù)測出了一些高度保守、可作為疫苗靶標(biāo)的抗原蛋白,多是未進(jìn)行功能分析和命名的新蛋白。相對于其它種類蛋白,細(xì)菌表面蛋白,具有暴露充分、數(shù)量眾多、與抗體接近更容易、能夠誘導(dǎo)更高水平免疫反應(yīng)等特點(diǎn),是研發(fā)預(yù)防該疾病的最佳疫苗候選目標(biāo)之一。本研究選取了3個被預(yù)測為具有免疫功能的無乳鏈球菌細(xì)胞表面蛋白,對其基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,克隆羅非魚源無乳鏈球菌3個蛋白的抗原表位區(qū)域,利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)和純化,分別建立以3個重組蛋白為包被抗原的間接ELISA檢測方法,并用3個重組蛋白制成的亞單位疫苗對奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)和大菱鲆進(jìn)行免疫保護(hù)性的研究。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.利用生物信息學(xué)原理分別分析、預(yù)測了Gen Bank公布的人源無乳鏈球菌2個細(xì)胞壁表面錨定蛋白(cell wall surface anchored protein)基因序列(Gen Bank序列號:CP000114.1,SAK_1503、SAK_0896)和1個脂蛋白(lipoprotein)基因序列(Gen Bank序列號:CP000114.1,SAK_0321)的Bepipred線性表位、抗原性、β-Turn、表面可及性、柔韌性和親水性區(qū)域,綜合以上參數(shù)確定3個細(xì)胞表面蛋白的B細(xì)胞抗原表位區(qū)域分別為29-183 aa、113-457 aa和31-144 aa區(qū)間,以此設(shè)計(jì)特異性引物,克隆羅非魚源無乳鏈球菌BX2012分離株3個細(xì)胞表面蛋白的目的片段,成功構(gòu)建的p ET-32a-CWSAP465、p ET-32a-CWSAP1035和p ET-32a-LIP342原核表達(dá)載體(Gen Bank序列號:KU759322、KU759323和KU759324),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá),分別獲得了分子量約為36、54和30 k Da的蛋白。蛋白經(jīng)His-Trap FF親和層析柱純化,得到的CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白純度分別由52.89%、36.40%和41.75%提高到94.25%、58.61%和87.23%。Western blotting結(jié)果表明,上述3個蛋白可被兔抗無乳鏈球菌高免血清特異性識別,具有較好的免疫反應(yīng)原性。2.與Gen Bank中相似序列分析比對結(jié)果顯示,CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白序列在目前所有已知的不同物種(人、牛、駱駝和羅非魚)或不同血清型(Ia、II、III、IV和V)無乳鏈球菌分離株中的同源性分別為96.13%-100%、99.13%-100%和90.35%-100%;在羅非魚源無乳鏈球菌分離株中,CWSAP465同源性為98.06%-100%,CWSAP1035為99.71%-100%,LIP342則為100%,證明3個蛋白都是高度保守的。推測除羅非魚以外,這3個蛋白對其他易感染無乳鏈球菌的魚類和牛等哺乳動物甚至是人類也可能具有相似或相同的免疫保護(hù)功能。3.分別建立了以CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白為包被抗原的間接ELISA檢測方法,經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化,確定CWSAP465和LIP342最適包被濃度為10 ng/μL,CWSAP1035的最適包被濃度為15 ng/μL,血清最佳稀釋倍數(shù)均為1:40;CWSAP465和CWSAP1035最佳封閉液為10%牛血清,LIP342最佳封閉液為5%BSA;最佳封閉時(shí)間均為0.5 h;最佳抗體孵育時(shí)間均為0.5 h;CWSAP465和CWSAP1035最佳底物作用時(shí)間為10 min,LIP342最佳底物作用時(shí)間為5min。CWSAP465-ELISA、CWSAP1035-ELISA和LIP342-ELISA方法的臨界值分別為0.243、0.309和0.288。特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示所建立的ELISA方法對遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)羅非魚陽性血清、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)羅非魚陽性血清、溫和氣單胞菌(A.sobria)羅非魚陽性血清以及豬鏈球菌2型(S.suis type 2)陽性血清呈陰性反應(yīng)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,3個ELISA方法板內(nèi)變異系數(shù)介于0.29%-5.33%之間,板間變異系數(shù)介于0.96%-7.13%之間,批間變異系數(shù)介于0.35%-8.91%之間。建立的CWSAP465-ELISA、CWSAP1035-ELISA和LIP342-ELISA方法具有良好的特異性和重復(fù)性,可為Ia血清型無乳鏈球菌疫苗抗體水平的檢驗(yàn)和Ia血清型無乳鏈球菌流行病學(xué)的調(diào)查提供參考。4.純化后的CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白分別以弗氏不完全佐劑制備成亞單位疫苗以檢驗(yàn)對奧利亞羅非魚和大菱鲆的免疫保護(hù)效果,設(shè)5個試驗(yàn)組和3個對照組,試驗(yàn)組分別為CWSAP465免疫組、CWSAP1035免疫組、LIP342免疫組、CWSAP465+CWSAP1035免疫組(2個CWSAP重組蛋白等比混合免疫組)、CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫組(3個重組蛋白等比混合免疫組),對照組分別為滅活疫苗對照組、PBS對照組和陰性對照組。免疫方式為一次性胸腔注射,注射劑量均為4μL/g魚體重,即重組蛋白免疫劑量為2μg/g魚體重。分別在奧利亞羅非魚和大菱鲆免疫后第0、7、14、21、28、35、42 d采集血清,用所建立的ELISA方法檢測抗體水平。結(jié)果表明,接受免疫的奧利亞羅非魚(42±8.52 g)和大菱鲆(64±10.38 g)均能顯著提高抗體水平(P0.05),并顯著高于滅活疫苗對照組(P0.05),抗體水平在免疫后第四周達(dá)到峰值,隨后因攻毒而下降。5.免疫后的第28 d進(jìn)行無乳鏈球菌攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,接受CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白5個試驗(yàn)組和滅活疫苗免疫后的奧利亞羅非魚和大菱鲆可有效抵御1×109 cfu/m L的無乳鏈球菌強(qiáng)毒攻擊(P0.05)。Kaplan-Meier生存檢驗(yàn)結(jié)果顯示,CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫組和CWSAP465+CWSAP1035免疫組奧利亞羅非魚累積生存率顯著高于滅活疫苗對照組(P0.05),CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫組大菱鲆的累積生存率顯著高于滅活疫苗對照組(P0.05)。CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫組對奧利亞羅非魚和大菱鲆的相對保護(hù)率(Relative percentage survival,RPS)均顯著高于滅活疫苗對照組(P0.05),CWSAP465免疫組、CWSAP1035免疫組、LIP342免疫組和CWSAP465+CWSAP1035免疫組雖與滅活疫苗對照組RPS差異不顯著(P0.05),但亦高于滅活疫苗。因此,由3個重組蛋白等比混合制備的疫苗免疫保護(hù)效果最為出色。綜上所述,本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)截短表達(dá)了羅非魚源無乳鏈球菌3個細(xì)胞表面蛋白,分別建立了以CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白為包被抗原的間接ELISA檢測方法,并評估了CWSAP465、CWSAP1035和LIP342作為候選疫苗的免疫保護(hù)能力。以上述3個重組蛋白制備的亞單位疫苗均可比滅活疫苗更為顯著地提高被接種的奧利亞羅非魚和大菱鲆的抗體水平,并可抵抗高毒力的無乳鏈球菌攻擊,證明3個細(xì)胞表面蛋白可作為無乳鏈球菌全菌滅活疫苗的替代品候選因子。本研究填補(bǔ)了大菱鲆無乳鏈球菌疫苗研究的空白,首次證明無乳鏈球菌亞單位疫苗和全菌滅活疫苗對大菱鲆具有免疫保護(hù)作用;更填補(bǔ)了這3個細(xì)胞表面蛋白在免疫保護(hù)方面的研究空白,為今后結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了基礎(chǔ),并證明了CWSAP465、CWSAP1035和LIP342是十分具有潛力的預(yù)防無乳鏈球菌病的候選因子,可嘗試作為疫苗廣泛應(yīng)用于魚類無乳鏈球菌病的預(yù)防。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S943
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本文編號：1284832