發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 08:12

  本文關(guān)鍵詞：土壤枝孢菌的分離鑒定及極端木聚糖酶的功能驗(yàn)證

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【摘要】：半纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一,分離半纖維素高效降解菌株,開發(fā)具有應(yīng)用潛力的新型木聚糖降解酶具有重要意義。本論文從新疆、青海、云南高原土壤中分離獲得17株枝孢菌(Cladosporium)。通過基因型(I~TS,AC~T和~TEF1)和表現(xiàn)型的分析,確定了 6個(gè)枝孢菌新種Cladosporium neopsychrotolerans SL-16~T(= CGMCC 3.18031~T)、C.paralimoniforme XJ4974~T(=CGMCC 3.18104~T)、C.prolongatum XJ5436~T(= CGMCC 3.18036~T)、C.sinuatum QH1-5~T(= CGMCC 3.18096~T)、C.tianshanenC.SL-14~T(= CGMCC 3.18033~T)和C.verruculosum QH1-6~T(= CGMCC 3.18099~T),極大豐富了枝孢菌種類,首次揭示了土壤是枝孢菌的重要生態(tài)位。來源于新疆天山雪蓮根際土的嗜冷C.tianshanenC.SL-14和耐冷C.neopsychrotolerans SL-16具有顯著的木質(zhì)纖維素降解能力。為挖掘新穎的極端木聚糖酶基因,對菌株SL-14和SL-16進(jìn)行了全基因組測序。菌株SL-14和SL-16的基因組分別為33.8 Mb和35.9 Mb,含有9,826個(gè)和13,456個(gè)基因,編碼8,002和11,684個(gè)功能蛋白。與嗜冷菌SL-14相比,耐冷菌SL-16含有更多的膜蛋白(967:518)和碳水化合物活性酶(571:408),且更多的碳水化合物活性酶參與植物細(xì)胞壁和木聚糖的降解(分別為235:215和46:19),從而在進(jìn)化上體現(xiàn)了適應(yīng)極端環(huán)境的優(yōu)勢并在新酶挖掘上具有重要價(jià)值。根據(jù)耐冷C.neopsychrotolernas SL-16的基因組分析結(jié)果,確定了一個(gè)木聚糖降解酶系,包括四個(gè)GH10木聚糖酶、一個(gè)GH11木聚糖酶和兩個(gè)GH43木糖苷酶�；�于定量PCR的基因表達(dá)水平分析,選取各家族表達(dá)水平最高的基因進(jìn)行基因克隆和大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)表達(dá)。重組Xyn1OA、Xyn11A、Xy143A都具有低溫酶的特性,最適溫度為35-40℃且熱不穩(wěn)定(40℃)。三酶底物特異性寬泛,具有很好的協(xié)同效果,同時(shí)或依次添加釋放的木糖量是單獨(dú)添加的總木糖量的15.32倍。在中性低溫條件下(pH 6.5 and 30℃),添加商業(yè)纖維素酶Neutral Max和Xyn11A→Xyn10A→Xy143A可以顯著提高玉米秸稈的糖化效率,促進(jìn)葡萄糖和木糖的生成(1.47倍和11.81倍)。通過去除木聚糖的物理屏障并將其轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的木糖,該低溫木聚糖降解酶系在生物燃料的節(jié)能、環(huán)保、高效生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用潛力。為獲得用于生產(chǎn)益生元木寡糖的木聚糖酶,從嗜熱真菌Mycothermus thermophilus CGMCC3.18119中克隆獲得四個(gè)GH11木聚糖酶編碼基因Mtxyn11A、Mtxyn11At、Mtxyn11B和Mtxyn11C,并成功在畢氏酵母Pichia pastoris GS115表達(dá)。四個(gè)重組酶具有高溫(65℃)和中性(pH 6.5-7.0)的酶學(xué)性質(zhì)以及很強(qiáng)的木聚糖降解能力(95.0-96.6%)。為了測定木寡糖對益生菌的促生長作用,以不同木聚糖酶的水解產(chǎn)物為唯一碳源,培養(yǎng)乳酸桿菌Lactobacillus brevis、L.rhamnosus.casei和L.plantarum。結(jié)果表明四株乳酸菌可以利用83.8-98.2%的木聚糖酶水解產(chǎn)物。MtXyn11A因高產(chǎn)率、高比活、高催化效率、高底物轉(zhuǎn)化率、所產(chǎn)的木寡糖促乳酸桿菌快速生長的優(yōu)點(diǎn),在生產(chǎn)和應(yīng)用方面具有重大的潛力。本研究首次報(bào)道了土壤來源的六個(gè)枝孢菌新種,完成了兩株低溫枝孢菌的全基因組測序和比較基因組學(xué)分析,并驗(yàn)證了一個(gè)低溫木聚糖降解酶系在降解木聚糖和木質(zhì)纖維素中的協(xié)同作用以及四個(gè)高溫木聚糖酶用于生產(chǎn)益生元木寡糖的潛力,為挖掘木聚糖酶的適溫機(jī)制提供了寶貴的研究材料,在工業(yè)酶的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S154

【參考文獻(xiàn)】

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1 王強(qiáng);范雪榮;高衛(wèi)東;陳堅(jiān);;棉針織物復(fù)合生物酶精練加工[J];紡織學(xué)報(bào);2006年07期

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本文編號：1287165