發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 11:02

  本文關(guān)鍵詞：薄皮甜瓜脂氧合酶CmLOX10和CmLOX13的原核表達(dá)、生化特性及啟動(dòng)子分析

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【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,在中國和東亞國家廣泛種植,和厚皮甜瓜比較,其主要特點(diǎn)是植株抗逆性和抗病性較差。前人研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過脂氧合酶(LOX)途徑可以產(chǎn)生茉莉酸類物質(zhì)(JAs)和綠葉揮發(fā)性物質(zhì)(GLVs),它們普遍被認(rèn)為是植物中調(diào)控防御相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子,因此研究LOX基因的功能可為通過基因工程提高薄皮甜瓜抗逆性提供一定的理論基礎(chǔ)。盡管最近幾十年來越來越多的植物中發(fā)現(xiàn)了新的LOX基因,但是對(duì)于薄皮甜瓜中LOXs基因的研究較少。隨著甜瓜基因組測(cè)序的完成,為薄皮甜瓜的LOX基因的克隆和功能分析提供了便利。在先前的研究中,從甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到18個(gè)LOX基因并分別命名為CmLOX01～CmLOX18,通過與其他植物中已鑒定的LOXs構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹后發(fā)現(xiàn),CmLOX10和CmLOX13在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚在一起且它們之間的氨基酸序列相似性較高,為58.11%。為了驗(yàn)證薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的基因功能,以薄皮甜瓜‘玉美人’為材料進(jìn)行研究,主要研究結(jié)果如下：1.通過RT-PCR和5'RACE技術(shù)相結(jié)合的方法,獲得了薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13基因的全長序列。CmLOX10 (GenBank:KT613843)的ORF長度為2709 bp,5’UTR和3’UTR的長度分別為47和118 bp。CmLOX10基因編碼902個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為102.301 kDa,等電點(diǎn)為6.0。CmLOX13 (GenBank:KT613844)的ORF長度為2721bp,5'UTR和3’UTR的長度分別為48和21 bp。CmLOX13基因編碼906個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為102.312 kDa,等電點(diǎn)為6.34。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),薄皮甜瓜CmLOX10與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫中GeLOX10有7個(gè)核苷酸和3個(gè)氨基酸的不同,而薄皮甜瓜CmLOX13與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫中GeLOX13有5個(gè)核苷酸和1個(gè)氨基酸的不同。2.使用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明CmLOX10和CmLOX13都含有PLAT和LOX保守結(jié)構(gòu)域,并且都含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽,分別為37和23個(gè)氨基酸。通過CmLOX10和CmLOX13氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)了許多與LOX蛋白功能相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域和氨基酸,并據(jù)此預(yù)測(cè)這兩個(gè)蛋白都為13-LOXs。3.以薄皮甜瓜嫩葉DNA為模板,通過PCR技術(shù)獲得了CmLOX10和CmLOX13啟動(dòng)子序列,其長度分別為2155 bp和2097 bp。通過序列比對(duì),CmLOX13和GeLOX13啟動(dòng)子序列之間的相似度為98.72%,而CmLOX10和GeLOX10啟動(dòng)子序列之間的相似度卻只有93.19%。使用PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫對(duì)擴(kuò)增獲得的CmLOX10和CmLOX13啟動(dòng)子中可能存在的順式作用元件進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了許多與激素和環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件,如與SA響應(yīng)相關(guān)的TCA-element元件,與生長素響應(yīng)相關(guān)的TGA-element元件,與GA響應(yīng)相關(guān)的GAREAT元件以及與創(chuàng)傷響應(yīng)相關(guān)的WUN-motif元件。4.通過薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的原核表達(dá)獲得CmLOX10和CmLOX13重組蛋白,依次經(jīng)過蛋白純化、SDS-PAGE鑒定、Western-blot鑒定和蛋白濃縮而獲得CmLOX10和CmLOX13純化蛋白。對(duì)最后得到的純化蛋白進(jìn)行酶活力分析表明,CmLOX10和CmLOX13的最適pH值分別為5.0和5.5,最適溫度分別為45℃和35℃;對(duì)CmLOX10和CmLOX13進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析表明,亞油酸是它們的最適底物；通過高效液相色譜(HPLC)法對(duì)CmLOX10和CmLOX13與亞油酸反應(yīng)后的底物的進(jìn)行分析表明,它們都是13-LOXs。5.使用Gateway法構(gòu)建CmLOX10和CmLOX13的過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,通過在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)的方法,觀察CmLOX10和CmLOX13蛋白的亞細(xì)胞定位。試驗(yàn)結(jié)果表明,CmLOX13蛋白的亞細(xì)胞定位與使用軟件預(yù)測(cè)的即定位在葉綠體的結(jié)果一致,而CmLOX10蛋白定位在細(xì)胞膜上,與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果不同。6.通過PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫對(duì)CmLOX10和CmLOX13啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析后,構(gòu)建薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13 5'缺失啟動(dòng)子植物表達(dá)載體。將CmLOX135’缺失啟動(dòng)子在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)后,對(duì)煙草葉片進(jìn)行激素和非生物脅迫處理,對(duì)處理后的煙草葉片經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和熒光定量分析表明p121GUS:13-5結(jié)構(gòu)的GUS活性明顯高于其它的5’缺失結(jié)構(gòu)并且CmLOX13啟動(dòng)子對(duì)除乙烯處理之外的ABA、SA、 GA、IAA、MeJA、創(chuàng)傷、冷害和高溫處理都是有響應(yīng)的。7.將構(gòu)建的CmLOX10和CmLOX13過表達(dá)載體通過花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥植株,最終經(jīng)過0.0005%除草劑Basta和RT-PCR鑒定篩選到了T1代轉(zhuǎn)基因植株,為進(jìn)一步鑒定薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的基因功能提供了材料。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S652

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1287633