發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 19:37

  本文關(guān)鍵詞：LPS刺激的奶牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和miRNA表達(dá)譜變化規(guī)律的研究

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【摘要】：奶牛乳房炎是一種嚴(yán)重影響奶牛業(yè)生產(chǎn)效益的疾病,革蘭氏陰性細(xì)菌是引起奶牛乳房炎的病原菌之一,乳腺作為病原的直接入侵部位,占乳腺組成70%的乳腺上皮細(xì)胞則在抵御病原入侵時(shí),發(fā)揮重要的免疫防護(hù)作用。為了揭示臨床型乳房炎過程中奶牛乳腺上皮細(xì)胞免疫機(jī)制的動(dòng)態(tài)變化過程。本研究通過革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)刺激牛乳腺上皮細(xì)胞,通過轉(zhuǎn)錄測序和小RNA測序技術(shù)獲得LPS刺激的0,4,8,12h牛乳腺上皮細(xì)胞中mRNA和miRNA表達(dá)譜,并且采用microRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)QT-PCR法和基因QT-PCR法,對(duì)測序結(jié)果中與免疫相關(guān)的分子在LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞和健康/患乳房炎牛的乳腺組織中,進(jìn)行定量表達(dá)分析。并對(duì)健康和患乳房炎奶牛乳腺組織樣品中的相關(guān)基因也進(jìn)行了表達(dá)譜分。最后,本文對(duì)相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性與中國荷斯坦奶牛生產(chǎn)性狀和體細(xì)胞評(píng)分(SCS)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。通過以上研究,得出以下結(jié)果:(1)miRNA和mRNA表達(dá)譜本研究中0h,4h,8h和12h樣本中總的mRNA表達(dá)量分別為797968,785310,776069,740583和總miRNA表達(dá)量分別為6500331,7487961,7179674,7518120,mRNA總的表達(dá)量變化趨勢是下降的,而miRNA是上升的。通過對(duì)顯著性差異表達(dá)的mRNA和miRNA進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集性分析,免疫應(yīng)答通路顯著富集在4h LPS刺激的牛乳腺細(xì)胞,而8,12h細(xì)胞沒有。(2)LPS刺激后的牛乳腺上皮細(xì)胞中關(guān)鍵的信號(hào)通路和炎癥應(yīng)答分子炎癥應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)通路,包括RIG-I樣受體信號(hào)通路,NOD樣受體信號(hào)通路,MAPK信號(hào)通路基因顯著富集在LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞。因此顯著富集在這些通路的42個(gè)mRNA和47個(gè)miRNA是牛乳腺上皮細(xì)胞在革蘭氏陰性細(xì)菌LPS刺激時(shí)的重要炎癥調(diào)節(jié)分子。(3)bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b在LPS刺激的乳腺上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)已有研究表明,在E.coli感染的MAC-T細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá);LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞中,bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b也呈現(xiàn)高表達(dá)。我們推測bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b可能在革蘭氏陰性細(xì)菌感染的牛乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用。(4)microRNA靶基因的偏好性分析在LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞和患病的乳腺組織中,同一有靶向關(guān)系的m RNA-mi RNA對(duì)的表達(dá)量變化,并不都呈現(xiàn)相反的動(dòng)態(tài)變化趨勢。我們推測,在不同的生理或病理狀態(tài)下,miRNA呈現(xiàn)靶標(biāo)基因的偏好性(priority target mRNA)。(5)I型干擾素通路(Type I interferon)在LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞中被激活在LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞中,I型干擾素通路基因的正調(diào)節(jié)因子顯著性增多,而在乳房炎乳腺組織,這些基因的表達(dá)量相對(duì)于健康組織顯著降低。(6)NF-κB通路在乳房炎組織處于動(dòng)態(tài)激活狀態(tài)在奶牛乳房炎過程中,NF-κB通路處于激活狀態(tài),而且通過不斷促進(jìn)抑制子IκB的轉(zhuǎn)錄來補(bǔ)充胞質(zhì)中不斷降解的IκB蛋白,來維持NF-κB通路炎癥免疫作用的動(dòng)態(tài)平衡。TLR4在LPS處理的牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)量增加,而且在患病乳腺組織中的表達(dá)量也顯著高于健康牛,因此推測TLR4是牛乳腺上皮細(xì)胞面對(duì)LPS作用時(shí)的受體分子。(7)揭示NF-κB通路的SNP位點(diǎn)與中國荷斯坦奶牛性狀顯著關(guān)聯(lián),可作為高產(chǎn)與抗乳房炎奶牛育種的DNA標(biāo)記來進(jìn)行MAS(Marker Assited Selection)。對(duì)于NF-κB通路基因上的SNP位點(diǎn),SNV1-T是產(chǎn)奶性狀和抗乳房炎優(yōu)勢等位基因;SNV2-A等位基因是乳房炎抗性優(yōu)勢基因;基因型SNV3-TC是高乳脂率優(yōu)勢基因型;SNV4-T是高乳脂率和抗乳房炎優(yōu)勢等位基因;基因型SNV7-AG是高乳蛋白優(yōu)勢基因型;SNV10-T和SNV14-C是高乳蛋白含量優(yōu)勢等位基因;基因型SNV13-TT個(gè)體是抗乳房炎個(gè)體。這些位點(diǎn)可以作為今后高產(chǎn)和抗乳房炎奶牛育種的標(biāo)記分子位點(diǎn)來進(jìn)行輔助育種。綜合以上結(jié)果,LPS刺激會(huì)引起乳腺上皮細(xì)胞的快速免疫應(yīng)答反應(yīng),在4h LPS刺激的細(xì)胞反應(yīng)最活躍,而且RIG-I樣受體信號(hào)通路(RIG-I-like receptor signaling pathway),NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway),MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)可能是奶牛乳房炎最活躍的免疫應(yīng)答通路。NF-κB通路在乳房炎的乳腺上皮細(xì)胞中處于抑制狀態(tài),而在乳房炎的乳腺組織中處于激活狀態(tài)。在奶牛乳房炎過程中,mi RNA和mRNA的互作呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,他們將多個(gè)信號(hào)通路聯(lián)系在一起,共同調(diào)節(jié)奶牛機(jī)體的炎癥應(yīng)答過程。在NF-κB通路基因獲得的SNP位點(diǎn),可以作為奶牛育種的輔助標(biāo)記分子。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
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本文編號(hào)：1289123