發(fā)布時(shí)間：2018-04-13 02:12

  本文選題：FcRn + IgG��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：大約95%以上病原微生物都是通過(guò)黏膜途徑入侵機(jī)體的,因此黏膜免疫日益受到人們的重視。一般認(rèn)為黏膜免疫主要是通過(guò)多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn),在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG,并在黏膜表面保護(hù)機(jī)體防止病原入侵的過(guò)程中起到重要作用。而IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜表面主要是通過(guò)新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor,FcRn)介導(dǎo)的。目前大量的研究主要集中在對(duì)人和小鼠的FcRn功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究,但是對(duì)于豬源的FcRn功能的研究比較少,同時(shí)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到有關(guān)病原感染對(duì)FcRn表達(dá)調(diào)控方面的研究。因此,本研究擬應(yīng)用豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型,研究豬FcRn介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運(yùn)功能;同時(shí)研究豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染IPEC-J2細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路對(duì)FcRn的表達(dá)調(diào)控。取得的主要研究結(jié)果如下:1.豬小腸上皮細(xì)胞FcRn的表達(dá)及分布根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的豬FcRnα鏈基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以IPEC-J2細(xì)胞的總RNA為模板,利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了FcRnα鏈基因片段。經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FcRn蛋白在IPEC-J2細(xì)胞系上的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FcRn主要分布在極化的IPEC-J2細(xì)胞的頂膜側(cè);仔豬空腸組織切片檢測(cè)結(jié)果也顯示FcRn主要分布在小腸絨毛上皮細(xì)胞的頂膜側(cè)。2.豬FcRn介導(dǎo)IgG雙向胞轉(zhuǎn)作用的研究以IPEC-J2細(xì)胞構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型,將生物素標(biāo)記的豬IgG(biotin-IgG)加入到胞轉(zhuǎn)模型,進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)極化的IPEC-J2細(xì)胞在37°C可以雙向轉(zhuǎn)運(yùn)IgG,在4°C不能轉(zhuǎn)運(yùn)IgG。以上結(jié)果證明IgG是跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)上皮細(xì)胞屏障。為了進(jìn)一步研究IgG跨極化上皮細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)是由FcRn特異性介導(dǎo)的,在biotin-IgG胞轉(zhuǎn)過(guò)程中加入protein A或未標(biāo)記的IgG作為抑制劑。結(jié)果顯示在加入protein A或未標(biāo)記的IgG后,明顯抑制了IgG雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果也證明了FcRn可以與IgG在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合并介導(dǎo)Ig G跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。運(yùn)用免疫共沉淀的方法證明了FcRn與IgG結(jié)合是pH依賴的,即在酸性條件下pH6.5,FcRn與IgG結(jié)合,在中性偏堿性條件下pH7.0,FcRn與IgG不結(jié)合。由于FcRn可以介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運(yùn),因此,在胞轉(zhuǎn)模型中,以TGEV為模式病原,將抗TGEV特異性IgG加入到細(xì)胞底側(cè)小室,在極化的IPEC-J2細(xì)胞頂側(cè)小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)特異性IgG能夠中和病毒。以上結(jié)果說(shuō)明Fc Rn介導(dǎo)IgG轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)黏膜屏障,在保護(hù)機(jī)體防止病原通過(guò)黏膜表面入侵的過(guò)程中起到重要作用。3.TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路對(duì)FcRn表達(dá)調(diào)控的研究NF-κB是一個(gè)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,主要涉及與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞能夠激活NF-κB信號(hào)通路。首先,運(yùn)用NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞對(duì)NF-κB的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)能顯著增強(qiáng)NF-κB熒光素酶活性。進(jìn)一步通過(guò)pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞,在TGEV感染后,激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示p65轉(zhuǎn)位入核。TGEV感染IPEC-J2細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)能顯著上調(diào)FcRn的表達(dá)。經(jīng)在線軟件分析FcRn啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)除了具有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)還有MAPK下游的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),因此為了確定NF-κB和MAPK在FcRn上調(diào)表達(dá)中的作用,應(yīng)用NF-κB抑制劑和MAPK相關(guān)抑制劑處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑處理的細(xì)胞能顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達(dá),而MAPK抑制劑處理的細(xì)胞不影響TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達(dá)。說(shuō)明FcRn的上調(diào)表達(dá)與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。進(jìn)一步根據(jù)在線軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)將FcRn啟動(dòng)子區(qū)域不斷截短,最終構(gòu)建了9個(gè)不同長(zhǎng)度的FcRn啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,經(jīng)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FcRn啟動(dòng)子區(qū)NF-κB主要結(jié)合位點(diǎn)位于上游的-1381~-208之間。最后應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明這個(gè)區(qū)域具有4個(gè)p65轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：1742468