發(fā)布時間：2018-05-02 13:19

  本文選題：棉花 + 黃萎病　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：棉花黃萎病是影響棉花生產(chǎn)的主要病害,乙烯信號路徑在棉花與黃萎病菌的互作中扮演著重要的角色。明確乙烯在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制,并調(diào)控乙烯信號路徑來改良棉花的抗病性對棉花抗病育種和生產(chǎn)具有重要意義。本研究從海島棉品種"7124"中克隆了乙烯信號路徑的一個ERFs類轉(zhuǎn)錄因子基因GbERF1-like,并對其在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的作用機(jī)制開展了研究,取得的主要結(jié)果有：1、克隆了GbERF1-like的全長序列,其ORF框?yàn)?37 bp,編碼179個氨基酸的多肽,含有一個59個氨基酸的ERFs類轉(zhuǎn)錄因子保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。序列聚類顯示GbERF1-like與GhERF1 (AY181251.1), GhERF8 (JN656957.1), TbERF (XM_007035031.1), GbERF5 (JN003808.1)和AtERF1 (AB008103)具有較高的同源性。表達(dá)分析顯示GbERF1-like在棉花的不同組織都有表達(dá),并能快速響應(yīng)ET、MeJA處理。相對于感病的陸地棉,GbERF1-like在抗病的海島棉接種黃萎病菌"V991”后上調(diào)表達(dá)迅速,并且持續(xù)的時間長。2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了GbERF1-like在棉花中的超量表達(dá)系COV20、COV5與抑制表達(dá)系Ci8、Ci6,以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達(dá)純系A(chǔ)OV12、AOV5。接種鑒定分析表明,GbERF1-like的超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉花和擬南芥的抗病性,而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花抗病性降低�；�因表達(dá)分析表明GbERF1-like在棉花中能正調(diào)控PR3、PR4的表達(dá),負(fù)調(diào)控PR1、PR5的表達(dá)。但在擬南芥中GbERF1-like能促進(jìn)AtPR3、AtPR4及AtPDF1.2的表達(dá),但抑制AtPR2的表達(dá)。此外,表達(dá)分析還顯示木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因表達(dá)受GbERF1-like表達(dá)水平的影響,GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT1、 GhCCoAOMT1和GhF5H2等基因在GbERF1-like超量表達(dá)棉花中表達(dá)上升,而在其抑制轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量下降。類似的結(jié)果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn),這暗示GbERF1-like可能在植物中參與木質(zhì)素合成的調(diào)控。此外,與Mock相比,接種黃萎病菌后GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)更為顯著。用Wiesner方法對棉花莖的木質(zhì)素染色結(jié)果顯示,Mock處理及"V991”處理后的各棉花材料均可被染為紅色,所有接種處理的著色明顯比Mock深。在Mock處理的各材料間,GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最深,而GbERF1-like抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最淺。木質(zhì)素總量測定與染色結(jié)果相符,接菌處理后,WT、轉(zhuǎn)基因系莖的木質(zhì)素總量均比Mock處理對應(yīng)材料顯著增加。在Mock及"V991”接種處理后,GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素總量分別比WT增加6.9%-44.3%,而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花中木質(zhì)素總量比WT降低13.2%-23.4%。木質(zhì)素單體測定表明,與Mock相比,各材料的G和S單體在接菌后都增加。在Mock及"V991”接種處理后,棉花G單體含量在超表達(dá)材料中比WT高但沒有達(dá)到顯著水平,RNAi系的G單體含量比WT顯著降低,在5.9%-12.4%之間。轉(zhuǎn)基因擬南芥與WT相比,G單體含量增加幅度在11.2%-31.6%之間。各棉花材料的S單體含量在兩種處理中,超表達(dá)材料含量較野生型增加10.8%-33.6%,而抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系下降,降低了7.4%-12.9%。擬南芥的S單體增加不明顯。3、分析顯示GhHCT1和AtPAL3兩個基因的啟動子序列均含有TAAT-box、 CAAT-box及GCCGCC-box的ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。利用酵母單雜交分析表明GbERF1-like與GhHCT1和AtPAL3的啟動子之間存在互作。利用雙分子熒光檢測進(jìn)一步證實(shí)GbERF1-like在棉花原生質(zhì)體中可以結(jié)合GhHCT1和AtPAL3基因的啟動子,并提高這兩個木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果證明GbERF1-like直接參與了棉花及擬南芥的木質(zhì)素合成調(diào)控。4、為了進(jìn)一步證明GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病增強(qiáng)與木質(zhì)素合成激活有關(guān),我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料COV20中的GhHCT1進(jìn)行了抑制。分子檢測、接種鑒定及木質(zhì)素含量測定表明,在抑制GhHCT1表達(dá)后,GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料的抗病性明顯降低,其莖部木質(zhì)素含量減少。同時木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)均受到影響,木質(zhì)素合成上游基因,如GhPAL1 (Gbscaffold40957.1)、GhPAL5、(Gbscaffold11559.9)、GhC4H (Gbscaffold12103.1)普遍表現(xiàn)為表達(dá)量降低,而木質(zhì)素合成下游的基因則普遍表現(xiàn)為表達(dá)水平上升,如GhCCR (Gbscaffold2152.13), GhCAD (Gorai.009G192400.1), GhFSH (Gbscaffold12698.2)和GhCOMT (Gorai.004G125600.1)。以上結(jié)果證明木質(zhì)素合成增強(qiáng)在GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有重要作用。5、通過酵母雙雜交篩選鑒定到部分與GbERF1-like互作的蛋白因子。部分因子為前期己報(bào)道參與棉花抗病反應(yīng)的蛋白,如MAPK, MLP, DIRIGENT(Cai et al.,2014;Yang et al.,2015; Hosmani et al.,2013)。此外也有部分互作蛋白的功能還未在棉花抗黃萎病反應(yīng)中有報(bào)道,如P450, HSP, ALLERGEN及GLYOXYLASE等。這些蛋白因子與GbERF1-like互作后對調(diào)控木質(zhì)素合成及棉花抗病反應(yīng)有何影響還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Cotton Verticillium wilt is the main disease affecting cotton production. Ethylene signaling pathway plays an important role in the interaction of cotton and Verticillium wilt. It is of great significance to clarify the regulation mechanism of ethylene in cotton resistance to Verticillium wilt response and to regulate the resistance of cotton to cotton resistance breeding and production by regulating the ethylene signal path to improve the resistance to cotton. A ERFs class transcription factor gene GbERF1-like of ethylene signal pathway was cloned from the island cotton variety "7124", and the mechanism of its action in cotton resistance to Verticillium wilt was studied. The main results were as follows: 1, the full-length sequence of GbERF1-like was cloned, the ORF frame was 537 BP, and the polypeptide of 179 amino acids was encoded. A 59 amino acid ERFs transcriptional factor conserved the AP2/ERF domain. Sequence clustering showed that GbERF1-like had high homology with GhERF1 (AY181251.1), GhERF8 (JN656957.1), TbERF (XM_007035031.1), GbERF5 (JN003808.1) and AtERF1. Fast response to ET, MeJA treatment. Compared with susceptible land cotton, GbERF1-like was up to up expression after inoculation of Verticillium wilt "V991" in disease resistant island cotton, and it continued to be.2 for a long time. Through agrobacterium mediated genetic transformation, GbERF1-like was obtained in the super expression line of GbERF1-like in cotton, COV20, COV5 and inhibitory expression lines Ci8, Ci6, and GbERF1-like. The overexpression of pure line AOV12 in Arabidopsis, AOV5. inoculation analysis showed that the overexpression of GbERF1-like enhanced the resistance of transgenic cotton and Arabidopsis, and the resistance of transgenic cotton with GbERF1-like expression decreased. The gene expression analysis showed that GbERF1-like could regulate PR3, PR4 expression, negative regulation of PR1, PR5 in cotton flower. But in Arabidopsis, GbERF1-like can promote the expression of AtPR3, AtPR4 and AtPDF1.2, but inhibit the expression of AtPR2. In addition, the expression analysis also shows that the gene expression of lignin synthesis pathway is affected by the level of GbERF1-like expression. The genes of GhPAL5, GhC4H1, GhC3H1, GhHCT1, GhCCoAOMT1 and GhF5H2 are in the super expression of cotton. The expression in the transgenic lines decreased. Similar results were found in Arabidopsis, suggesting that GbERF1-like may be involved in the regulation of lignin synthesis in plants. In addition, the GbERF1-like overexpression of GbERF1-like after inoculation of Verticillium Wilt in cotton and the pathway correlation of lignin synthesis in Arabidopsis thaliana after inoculation of Verticillium wilt. The expression of the expression was more significant. The results of lignin staining of cotton stems by Wiesner method showed that all cotton materials treated with Mock and "V991" could be dyed red, and the coloring of all the treatments was much deeper than that of Mock. Among the materials treated with Mock, the GbERF1-like super expression of transgenic cotton was dyed the most, and GbERF1-li Ke inhibited the expression of transgenic cotton with the most light staining. The total lignin content was in accordance with the staining results. After the treatment, the total lignin content of the transgenic lines was significantly higher than that of the Mock treatment. After the Mock and "V991" inoculation, the total amount of lignin in the transgenic cotton was higher than that of the WT. The total lignin in Arabidopsis thaliana was increased respectively than that of WT after the Mock and "V991" inoculation. Adding 6.9%-44.3%, the total lignin content in transgenic cotton with inhibition of GbERF1-like expression was lower than WT 13.2%-23.4%. lignin monomers. Compared with Mock, the G and S monomers of each material increased after inoculation. After Mock and "V991" inoculation, the content of G monomer in cotton was higher than that of WT but did not reach significant level. The content of G monomer in I system was significantly lower than that of WT. Compared with WT, the content of G monomer in transgenic Arabidopsis was increased by 11.2%-31.6%. The content of S monomer in each cotton material was in two treatments, the content of super expression material increased 10.8%-33.6% compared with the wild type, while the transgenic line decreased and the 7.4%-12.9%. South was reduced. The increase of S monomer in mustard was not significant.3. Analysis showed that the promoter sequences of two genes of GhHCT1 and AtPAL3 all contained TAAT-box, CAAT-box and GCCGCC-box ERF transcription factors combined with cis elements. It was confirmed that GbERF1-like could combine the promoter of GhHCT1 and AtPAL3 gene in the cotton protoplast and improve the transcriptional activity of the two key lignin synthesis genes. The above results show that GbERF1-like directly participates in the synthesis and regulation of.4 in cotton and Arabidopsis lignin synthesis, in order to further prove that GbERF1-like mediated cotton resistance to Verticillium wilt is increased. Strongly related to the activation of lignin synthesis, we used virus mediated gene silencing technology to inhibit GhHCT1 in the GbERF1-like overexpressed cotton material COV20. Molecular detection, inoculation identification and lignin content determination showed that after inhibition of GhHCT1 expression, the resistance of GbERF1-like overexpressed cotton material was significantly reduced, its stem The content of lignin in the xylem decreased and the expression of lignin related genes were affected. The upstream genes of lignin synthesis, such as GhPAL1 (Gbscaffold40957.1), GhPAL5, (Gbscaffold11559.9), and GhC4H (Gbscaffold12103.1), generally showed a decrease in expression, while the genes downstream of lignin synthesis were generally expressed as the level of expression, such as Gh. CCR (Gbscaffold2152.13), GhCAD (Gorai.009G192400.1), GhFSH (Gbscaffold12698.2) and GhCOMT (Gorai.004G125600.1). The above results show that lignin synthesis has an important role in GbERF1-like mediated cotton resistance to Verticillium wilt reaction,.5, and the protein factor interacting with GbERF1-like is identified by yeast two hybrid screening. Some factors are the proteins that have been reported to participate in the resistance of cotton in the earlier period, such as MAPK, MLP, DIRIGENT (Cai et al., 2014; Yang et al., 2015; Hosmani et al., 2013). Besides, some of the functions of the mutual protein are not reported in the cotton resistance to Verticillium wilt. The effect of interaction on lignin biosynthesis and cotton disease resistance remains to be further studied.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.62

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本文編號：1834086