發(fā)布時(shí)間：2018-05-05 05:31

  本文選題：油菜 + 透明種皮1(TT1)　； 參考：《西南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：油菜是世界上四大主要油料作物之一,屬于十字花科蕓薹屬。油菜3個(gè)栽培種之一的甘藍(lán)型油菜(2n=38,AACC)是遍及世界的重要油料作物,也是我國(guó)最大的油菜籽作物。在提高單產(chǎn)的同時(shí)提高油菜籽的含油量和品質(zhì)一直是當(dāng)代油菜育種的核心目標(biāo),黃籽油菜較相同遺傳背景下的黑籽油菜有含油量高、種子種皮薄、色素雜質(zhì)少和菜油品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn),因此油菜黃籽性狀是油菜育種中一個(gè)重要的育種目標(biāo)。甘藍(lán)型油菜雖然是三種油菜栽培種中籽粒產(chǎn)量最高的種類,但缺乏天然的甘藍(lán)型油菜黃籽材料。甘藍(lán)型油菜籽粒顏色與類黃酮生物合成這個(gè)次生代謝途徑高度相關(guān),深入研究甘藍(lán)型油菜類黃酮途徑,不僅有助于深入理解甘藍(lán)型油菜種皮顏色的形成機(jī)制,而且對(duì)于甘藍(lán)型油菜黃籽育種目標(biāo)具有重要意義。在本研究中,我們對(duì)甘藍(lán)型油菜種子類黃酮生物合成調(diào)控相關(guān)的一個(gè)調(diào)控因子BnTT1進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因功能鑒定。主要結(jié)果如下:1 BnTT1基因家族RNAi轉(zhuǎn)基因表型轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜4個(gè)株系生長(zhǎng)發(fā)育較中雙10號(hào)野生正常株系遲緩,苗期的轉(zhuǎn)基因株矮小,且抽薹開花延遲,花后的轉(zhuǎn)基因株系可以正常授粉結(jié)籽,末花期的轉(zhuǎn)基因株能達(dá)到中雙10號(hào)正常株的株高,但分枝數(shù)減少。種子表型調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因株系成熟種子呈黃色、籽粒小、千粒重低(平均下降了26.67%),種子顯微切片顯示轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育中種子和成熟種子的種皮都變薄。2 BnTT1基因家族調(diào)控類黃酮生物合成和影響油菜種子發(fā)育在我們對(duì)甘藍(lán)型油菜的研究中,BnTT1基因家族的沉默抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因油菜成熟種子呈現(xiàn)黃色并伴隨種子變小、千粒重下降和種皮變薄等一系列轉(zhuǎn)基因特征。對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)育中種子的解剖觀察顯示轉(zhuǎn)基因發(fā)育中種子的內(nèi)種皮和外種皮都變薄,油菜內(nèi)種皮和外種皮的解剖顯示共有五層細(xì)胞層,一層表皮細(xì)胞層(表皮層)和三層?xùn)艡诩?xì)胞層(柵欄層)構(gòu)成外種皮,一層內(nèi)皮細(xì)胞層(內(nèi)皮層)構(gòu)成內(nèi)種皮。在發(fā)育中種子的比較中,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子?xùn)艡趯拥募?xì)胞變小變薄,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因種子?xùn)艡趯幼儽?連同變薄的內(nèi)皮細(xì)胞層一起促成轉(zhuǎn)基因種子種皮變薄。這些結(jié)果表明,BnTT1基因家族可以影響油菜種子?xùn)艡诩?xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層的形態(tài)發(fā)育。同時(shí),香草醛和TBO的染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因種子的種皮兒茶素和酚類化合物積累下降。RNA-seq比較分析顯示轉(zhuǎn)基因種子中大量參與類黃酮生物合成的基因表達(dá)發(fā)生了改變,同時(shí),qRT-PCR分析顯示轉(zhuǎn)基因種子中CHS/TT4、DFR/TT3、LDOX/TT18、ANR/BAN、TT12、CFI/TT5、F3H/TT6和GSTF12/TT19等類黃酮生物合成與運(yùn)輸相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生了顯著下調(diào),作為這些類黃酮生物合成基因表達(dá)下調(diào)的后果,轉(zhuǎn)基因油菜種子類黃酮如表兒茶素、槲皮素及其衍生物(Qn-3-O-sophoroside,Qn-3-O-glucoside-1)、異鼠李素及其衍生物(Is-3-O-glucoside,Is-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、山萘酚衍生物(Km-3-O-glucoside-7-O-glucoside)、可溶性原花青素(原花青素B2[DP 2]、[DP 2]-2、[DP 3]、[DP 3]-2、[DP 4])和不溶性原花青素含量均顯著低于中雙10號(hào)對(duì)照種子,這些結(jié)果表明BnTT1基因家族調(diào)控類黃酮生物合成,BnTT1的功能缺失導(dǎo)致類黃酮合成與運(yùn)輸一系列關(guān)鍵基因表達(dá)的下調(diào),導(dǎo)致表兒茶素及其低聚物積累水平顯著下降,最終促成轉(zhuǎn)基因種子的顏色變化。調(diào)查還顯示,在CHS/TT4,DFR/TT3,LDOX/TT18,ANR/BAN,TT12,CFI/TT5,F3H/TT6以及GSTF12/TT19等主要的類黃酮生物合成與運(yùn)輸基因表達(dá)顯著下調(diào)的同時(shí),一些類黃酮晚期生物合成基因如LAC15/TT10以及一些UGT(包括UGT73B3、UGT73B2、UGT73C5和UGT73C1)的表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào),LAC15等基因表達(dá)雖然顯著上調(diào),但是不溶性原花青素水平還是下降了,表明原花青素前體物質(zhì)如表兒茶素的含量嚴(yán)重不足。以上成分分析和定量PCR證據(jù)共同表明,油菜BnTT1家族在調(diào)控種皮色素的同時(shí)也調(diào)控種胚黃酮醇積累,油菜BnTT1家族器官組織表達(dá)特異性分析顯示油菜TT1不僅在種皮中優(yōu)勢(shì)表達(dá),而且在種胚中也顯著表達(dá),意味著BnTT1基因家族可能直接參與調(diào)控油菜種胚的發(fā)育和代謝。另外,解剖觀察顯示油菜不僅內(nèi)種皮變薄,而且種皮的主要實(shí)體部分——柵欄層也變薄,暗示在甘藍(lán)型油菜中BnTT1不僅參與內(nèi)種皮發(fā)育,對(duì)外種皮發(fā)育也有影響。3 BnTT1基因家族影響公共苯丙烷途徑基因的表達(dá)RNA-seq對(duì)比分析顯示轉(zhuǎn)基因系苯丙烷途徑基因表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變,其中參與公共苯丙烷途徑的三個(gè)酶基因表達(dá)均發(fā)生了不同程度的下調(diào),qRT-PCR分析顯示PAL、C4H和4CL基因總體表達(dá)均顯著下調(diào),但各基因各員之間卻有著不同的表達(dá)模式,提示成員之間可能具有不同的功能分工,同時(shí)BnTT1基因家族的沉默對(duì)公共苯丙烷途徑基因表達(dá)的影響具有選擇性,如4CL基因家族成員中僅對(duì)參與類黃酮生物合成的4CL3的表達(dá)造成影響,由此可以推測(cè)BnTT1選擇性調(diào)控參與類黃酮生物合成的基因成員。4沉默BnTT1基因家族會(huì)明顯上調(diào)種皮木質(zhì)素生物合成木質(zhì)素途徑是苯丙烷途徑的分支途徑,DEG分析顯示木質(zhì)素途徑基因表達(dá)譜明顯發(fā)生了變化,主要表現(xiàn)在β-葡糖苷酶基因家族和過氧物酶基因家族以及HCT、CAD、F5H1、UGT84A等基因,qRT-PCR調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因種子中C3H、CAD、CCo AOMT、F5H、F5H1和UGT84A等基因表達(dá)發(fā)生了輕微的上調(diào),而COMT1、CCo AOMT1等基因則發(fā)生了輕微的下調(diào),總體上表現(xiàn)為上調(diào),作為這些基因表達(dá)變化的影響,轉(zhuǎn)基因種子木質(zhì)素含量水平也發(fā)生輕微的變化,表現(xiàn)為一定程度但達(dá)到顯著水平的上升,表明BnTT1基因家族沉默對(duì)木質(zhì)素合成與代謝造成的影響較輕,有可能是類黃酮分支途徑物質(zhì)流的嚴(yán)重下降導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)性旁支途徑——木質(zhì)素途徑物質(zhì)流顯著增加,木質(zhì)素途徑基因表達(dá)相應(yīng)上調(diào),種皮木質(zhì)素合成與積累含量上升。5 BnTT1基因家族影響脂肪酸生物合成與代謝作為一類脂肪族羧酸,脂肪酸在植物種子中分布廣泛,在植物的整個(gè)生命周期發(fā)揮著重要的作用。目前TT1在種子脂肪酸生物合成和代謝中所扮演的角色與功能仍然未知。在這項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)BnTT1基因家族的表達(dá)抑制導(dǎo)致脂肪酸組分發(fā)生顯著的改變,包括C18:1含量的下降(-12.41%)和C18:2、C18:3含量的增加(+30.08%,+25.59%),同時(shí),總脂肪酸含量沒有明顯改變。伴隨著這種成分變化,編碼質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脂肪酸生物合成關(guān)鍵酶的基因群表達(dá)譜表現(xiàn)出相應(yīng)的改變,包括ω-6脂肪酸去飽和酶基因FAD6、ω-3脂肪酸去飽和酶基因FAD3和硬脂酰-ACP脫氫酶基因AACPD等基因。FAD6和FAD3基因表達(dá)的顯著上調(diào),很可能分別是轉(zhuǎn)基因種子C18:2和C18:3脂肪酸明顯增加的原因。AACPD2、AACPD3和AACPD5等基因小幅上調(diào),則導(dǎo)致C18:0脂肪酸輕微上調(diào)。β-酮脂酰-ACP合成酶基因KASII表達(dá)的輕微下調(diào),則可能是C16:0脂肪酸略微增加的原因。調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因種子總脂水平?jīng)]有明顯變化,相應(yīng)的,ACCase酶兩個(gè)同聚型基因ACC1、ACC2及異聚型四個(gè)亞基基因表達(dá)均沒有變化。此外,在種子的成熟過程中調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因,B3結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ABI3、核轉(zhuǎn)錄因子L1L和LEC1表達(dá)顯著上調(diào),因此推測(cè)BnTT1是ABI3、LEC1和L1L等脂肪酸生物合成調(diào)控基因的潛在調(diào)控子,BnTT1功能缺失導(dǎo)致ABI3、LEC1和L1L表達(dá)異常,進(jìn)而改變了FAD6、FAD3、KASII和AACPD等基因的轉(zhuǎn)錄水平,最終導(dǎo)致脂肪酸組分和種子發(fā)育的改變。這些結(jié)果暗示油菜TT1除調(diào)控類黃酮次生代謝外可能也參與種子脂肪酸初生代謝。6 BnTT1基因家族對(duì)甘藍(lán)型油菜植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響轉(zhuǎn)基因株系苗期到花期的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因株系較中雙10號(hào)對(duì)照生長(zhǎng)發(fā)育延遲,形態(tài)上發(fā)苗60d的轉(zhuǎn)基因植株明顯比同期的中雙10號(hào)對(duì)照矮小,抽薹開花也相應(yīng)延遲5-10d左右,成熟的轉(zhuǎn)基因植株在株形和株高上與中雙10號(hào)對(duì)照沒有顯著性差異,但分枝數(shù)減少,這些現(xiàn)象提示BnTT1基因家族可能參與調(diào)控油菜植株的生長(zhǎng)發(fā)育。但BnTT1基因器官組織表達(dá)特異性分析顯示BnTT1在油菜營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉中并沒有表達(dá),因此推測(cè)轉(zhuǎn)基因株系苗期生長(zhǎng)發(fā)育遲緩并不是BnTT1基因家族被沉默后的直接影響,而且,轉(zhuǎn)基因各株系植株在生長(zhǎng)發(fā)育的末期都可以達(dá)到中雙10號(hào)正常株的株高,此外,組培的轉(zhuǎn)基因T1代也未能觀測(cè)到這個(gè)表型差異,因此,我們推測(cè),T2、T3代轉(zhuǎn)基因株系植株之所以生長(zhǎng)發(fā)育較緩慢,很有可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因種子發(fā)育不良,轉(zhuǎn)基因種子籽粒顯著小于中雙10號(hào)正常種子,種子內(nèi)代謝組分如類黃酮物質(zhì),尤其是黃酮醇水平大幅度下降,種子發(fā)育異常以及物質(zhì)儲(chǔ)備較少導(dǎo)致種子萌發(fā)以及后期的生長(zhǎng)發(fā)育異常,即種子大小、種子結(jié)構(gòu)和種子成分改變導(dǎo)致的間接效應(yīng),受此負(fù)效應(yīng)影響,轉(zhuǎn)基因植株苗期生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,抽薹開花也晚于野生正常株,最后所能產(chǎn)生的分枝也相應(yīng)減少。
[Abstract]:Brassica napus ( Brassica napus L . ) is one of the four major oil crops in the world . The Brassica napus L . ( 2n = 38 , AACC ) is one of the most important oil crops in the world . The results showed that the gene family of Brassica napus L . could be directly involved in regulating the development and metabolism of seed embryo . In this study , we found that the gene expression profile of pTT1 gene family could be increased significantly . There was no significant difference in the expression of FAD6 , 蠅 - 3 fatty acid desaturated enzyme gene FAD3 and stearylacyl - ACP dehydrogenase gene AACPD . The seed germination , seed structure and seed composition change caused the seed germination , seed structure and seed composition change caused by the negative effect . The growth and development of transgenic plants were slow , the flowering of bolting and flowering were later than that of the wild normal plant , and the branches could be reduced correspondingly .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S565.4
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本文編號(hào)：1846437