發(fā)布時間：2018-05-10 12:28

  本文選題：石斛 + 美孢膠膜菌��； 參考：《中國林業(yè)科學研究院》2017年博士論文

【摘要】：石斛為主要蘭科植物之一,主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶,我國大部分分布于西南、華南、臺灣等地。由于石斛種子極其微小,無胚乳,其自身營養(yǎng)不足以支持種子萌發(fā),自然條件下往往依賴與之共生的內(nèi)生真菌建立共生關(guān)系后才能夠發(fā)芽,石斛-菌根真菌的共生關(guān)系對于石斛種群繁衍極其重要。目前雖然已經(jīng)從蘭科植物中分離獲得多種共生真菌,但石斛-真菌共生分子機制研究卻相對滯后。本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建菌根真菌與石斛種子的共培養(yǎng)體系。利用RNA-seq技術(shù)對真菌與石斛共生和非共生狀態(tài)下的材料進行轉(zhuǎn)錄組測序,分別研究石斛在與真菌共生和非共生條件下石斛與真菌的基因表達模式和表達水平差異,挖掘與共生相關(guān)的關(guān)鍵基因,運用生物信息學方法對相關(guān)基因進行全基因組預(yù)測分析,解析 石斛—菌根真菌‖共生分子調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1.從6個春蘭和蕙蘭樣品中共分離到40種內(nèi)生細菌,分布在15個不同的屬內(nèi)。還分離得到3株潛在新菌。內(nèi)生細菌鑒定為后續(xù)蘭科植物與根際微生物共生機制研究奠定了基礎(chǔ)。2.選用分離自湖北隨州野生春蘭(Cymbidium goeringii)根部的美孢膠膜菌菌株Tcg(Tulasnella calospora),利用8.0 g·L-1的燕麥培養(yǎng)基建立石斛種子與美孢膠膜菌共生萌發(fā)體系,通過臺盼藍染色在共生萌發(fā)的種子內(nèi)部檢測到共生真菌菌絲。3.采用RNA-seq技術(shù)對共生萌發(fā)種子(DoTcg)、非共生萌發(fā)種子(Do)、非共生美孢膠膜菌(Tcg)共9份樣品(每組設(shè)置三個生物學重復)進行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得96 G高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。樣品間生物學重復系數(shù)(R2)介于0.97-0.99之間,生物學重復性好。對石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行有參考基因組分析,45%-60%轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)mapping到石斛基因組上,其中比對到exon區(qū)域的reads比例在70%左右,比對到intron區(qū)域的reads數(shù)量最少,比對到基因間隔區(qū)的reads數(shù)量在25%左右。基于已發(fā)表的石斛基因注釋文件發(fā)現(xiàn)新的功能基因,并對已知基因進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,最終對16 872個基因進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,可以對石斛基因組數(shù)據(jù)庫進行補充。4.美孢膠膜菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采取de novo拼接組裝,共獲得transcripts序列58 967條,其中長度大于1000 bp的unigenes序列為15 257條,占25.87%,N50 unigene序列長度為1 488 bp。在6個美孢膠膜菌轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中檢測到的SNP位點數(shù)約6.5-7.0萬,其中非編碼序列的SNP位點約為1.5-1.7萬,編碼序列的SNP位點約為5萬,其中大部分SNP位點為同義替換。5.對共生和非共生樣品中差異表達基因分析發(fā)現(xiàn),在石斛與菌根菌共生萌發(fā)的種子中預(yù)測獲得5類激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)差異表達基因:9個參與ABA信號轉(zhuǎn)導基因、4個參與GA信號轉(zhuǎn)導途徑基因、15個參與IAA信號轉(zhuǎn)導途徑基因、1個參與油菜素甾醇信號通路基因、10個參與細胞分裂素信號途徑基因。在共生菌根真菌美孢膠膜菌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中檢測獲得6個差異表達的甘氨酸/絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因差異表達顯著,4個赤霉素受體蛋白基因GID1差異表達顯著,7個AUX/IAA家族蛋白基因差異表達顯著,3個生長素響應(yīng)和受體蛋白上調(diào)差異顯著。在共生萌發(fā)的種子與共生的美孢膠膜菌中均預(yù)測獲得一些與礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)運與吸收相關(guān)的基因。在石斛6個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢測到44類共333個轉(zhuǎn)錄因子序列在共生與非共生萌發(fā)的種子中差異表達。這些在共生和非共生樣品中差異表達的基因可能參與石斛與菌根菌共生體系的建立。6.利用石斛已經(jīng)發(fā)表的genome數(shù)據(jù),采用生物信息學方法對石斛DoPC、DoWRKY家族基因進行全基因組范圍內(nèi)預(yù)測分析,對其蛋白結(jié)構(gòu)特點、基因結(jié)構(gòu)特點、基因進化情況、及其在共生和非共生萌發(fā)種子中的表達情況進行了分析。結(jié)構(gòu)顯示:石斛全基因組中共預(yù)測到包含PCLD結(jié)構(gòu)域的38個DoPCs,可分屬4個亞家族,兩個Cys殘基在DoPCs家族中高度保守;19條DoPCs蛋白序列含有4個完整的保守銅結(jié)合配體(His、Cys、His、Gln/Met),有32條DoPCs骨架中含有N-端信號肽,22條DoPCs含有糖基磷脂酰肌醇錨定位點,有27條DoPCs含N-糖基化位點;16個DoPCs基因在與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的種子中檢測到表達,其中DoUCL2,4和DoENODL14基因表達量最高,7個基因在共生萌發(fā)的種子中明顯上調(diào)表達,只有DoENODL6基因明顯下調(diào)表達。本研究共獲得52條DoWRKY氨基酸序列,其中,7條序列含有2個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域,45條序列含有1個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域;選取DoWRKY基因上游1.5-kb區(qū)域序列,通過在線PLANTCARE數(shù)據(jù)庫進行啟動子區(qū)順式作用元件的預(yù)測,結(jié)果對48條基因啟動子區(qū)參與鹽/干旱誘導的MYB-binding位點,低溫、真菌、MeJA和熱擊響應(yīng)元件等12種順式作用元件的種類及數(shù)量進行了統(tǒng)計。所有在啟動子區(qū)預(yù)測到順式作用元件的48個genes中,至少包含2種脅迫或激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,說明它們可能參與多種脅迫或激素應(yīng)答。在共生萌發(fā)種子中共檢測到7個DoWRKY家族基因差異表達,而且這些基因均在共生萌發(fā)的種子中上調(diào)表達。其中,DoWRKY08基因表達差異最顯著;DoWRKY20和31兩個基因在共生萌發(fā)的種子呈現(xiàn)高表達現(xiàn)象。在全基因組范圍內(nèi)分析石斛DoPC、DoWRKY家族蛋白結(jié)構(gòu)特點,可以為探究蘭科植物與微生物共生的相互作用,進一步解析蘭科菌根形成的分子機制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
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本文編號：1869313