發(fā)布時(shí)間：2020-10-26 00:14

　　 RNA酶促共價(jià)研究,尤其是6-甲基腺嘌呤(m6A),開(kāi)啟了RNA生物學(xué)研究的一個(gè)新領(lǐng)域。m6A修飾是真核生物mRNA內(nèi)部序列中最常見(jiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后修飾形式,是一個(gè)由甲基化酶復(fù)合物(METTL3, METTL14, WTAP等)和去甲基化酶(FTO, ALKBH5等)共同調(diào)控的動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程,主要發(fā)生在RRACH (R=purine, H=A, C或U)的保守基序上,但不能排除其他基序的存在。RNA m6A轉(zhuǎn)錄后修飾具有重要的功能,而特定的"reader"蛋白可以專(zhuān)一識(shí)別并引導(dǎo)它們行使相應(yīng)的功能,包括影響mRNA的出核、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、降解和可變剪切等。高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合免疫沉淀方法的MeRIP-seq (m6A-seq)技術(shù)使全基因組范圍內(nèi)深入地研究m6A的分布和功能等變得可行,然而用于分析大規(guī)模m6A測(cè)序數(shù)據(jù)的方法和軟件相對(duì)匱乏。鑒于此,本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括兩個(gè)方面：一是首次研究并開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單易用的m6A測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件包MeRIP-PF;二是采用MeRIP-PF技術(shù),首次開(kāi)展了水稻多組織RNA m6A修飾譜的繪制與比較研究。MeRIP-PF是一款專(zhuān)門(mén)針對(duì)MeRIP-seq數(shù)據(jù),快速鑒定m6A修飾區(qū)域的數(shù)據(jù)分析軟件,其基本原理是通過(guò)比較對(duì)照樣品和IP樣品測(cè)序數(shù)據(jù)在基因組/轉(zhuǎn)錄本上的分布,經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),鑒定m6A的修飾區(qū)域,具體為首先將對(duì)照和IP樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上,并統(tǒng)計(jì)每個(gè)分割窗口(Bin=25bp)的讀段數(shù)；然后通過(guò)比較每個(gè)窗口讀段數(shù)的分布計(jì)算顯著性差異的p值和FDR值：最后,FDR≤0.05作為區(qū)分可信的m6A修飾區(qū)域與背景區(qū)域的判定值。MeRIP-PF還提供了基因?qū)哟魏蚿eak層次的注釋信息,主要包括peak的大小、位置、甲基化程度等,同時(shí)對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行了圖示化展示,如所有peak在轉(zhuǎn)錄組水平的分布特征、測(cè)序讀段在基因各個(gè)注釋位置的分布特征、單個(gè)修飾基因peak的展示以及peak的甲基化程度與基因表達(dá)豐度的相關(guān)性。MeRIP-PF采用Perl語(yǔ)言編寫(xiě),已發(fā)布在http://software.big.ac.cn/MeRIP-PF.html網(wǎng)站,用戶(hù)可免費(fèi)下載使用。借助MeRIP-seq技術(shù),我們首次開(kāi)展了水稻不同組織(愈傷組織、葉片組織以及4個(gè)不同萌發(fā)時(shí)間點(diǎn)的種胚)RNA m6A甲基化修飾譜的比較研究。首先,分別從mRNA、基因和染色體水平揭示了水稻m6A修飾的分布特征：(1)m6A在mRNA上的分布與哺乳動(dòng)物(如人、小鼠等)類(lèi)似,主要分布在CDS區(qū)和3’UTR區(qū)；(2) m6A peak在單個(gè)基因上的分布存在較大差異,平均每個(gè)基因攜帶兩個(gè)m6A修飾位點(diǎn),關(guān)聯(lián)分析顯示基因上peak的不等分布與修飾基因的基因結(jié)構(gòu)特征(外顯子數(shù)目、基因全長(zhǎng)和內(nèi)含子長(zhǎng)度等)及基因表達(dá)水平相關(guān)；(3) m6A peak傾向于分布在染色體兩端的端粒區(qū),而越靠近著絲粒區(qū)peak密度越低,即呈現(xiàn)一個(gè)"2-terminal hot"的分布特征,此外,m6A peak在不同染色體上的分布密度也不盡相同,我們推測(cè)其密度可能與染色質(zhì)的狀態(tài)和構(gòu)象密切相關(guān)。其次,通過(guò)比較水稻愈傷組織和葉片組織的m6A修飾譜,分別發(fā)現(xiàn)了626和5,509個(gè)SMGs(Selectively m6A-Modified Gene)并探索了可能的機(jī)制。功能分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組織的SMGs分別主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的功能類(lèi)和與光合作用密切相關(guān)的功能類(lèi)中。進(jìn)一步與已知RBP結(jié)合motif的比較發(fā)現(xiàn),葉片組織的SMGs中富集的保守序列UGUAMM (M=A|C),與PUM蛋白結(jié)合RNA的基序非常類(lèi)似,而水稻基因組中6個(gè)PUM家族基因在葉片組織中呈現(xiàn)全部下調(diào)或者接近不表達(dá)的狀態(tài)。據(jù)此我們提出了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的模型,即細(xì)胞中某些RBP(如PUM)的表達(dá)會(huì)阻礙甲基化酶與RNA的結(jié)合從而阻礙m6A修飾的生成,而相反如果這些RBP在某一特定組織或某一組織的特定時(shí)期中為極低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài),m6A甲基化酶就可以在無(wú)阻力的情況下進(jìn)入甲基化修飾的區(qū)域行使功能,從而造成了這些特定組織或特定時(shí)期樣品中選擇性甲基化基因的出現(xiàn)。最后,我們?cè)诓煌劝l(fā)時(shí)間點(diǎn)種胚的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組數(shù)據(jù)的分析中發(fā)現(xiàn),眾多萌發(fā)早期關(guān)鍵調(diào)控基因(激素類(lèi)代謝相關(guān)的基因、貯藏蛋白、LEA蛋白等)的m6A水平都發(fā)生了顯著變化,提示m6A可能參與水稻早期萌發(fā)過(guò)程的調(diào)控。綜上所述,本研究工作中我們首次研發(fā)了簡(jiǎn)單易用的m6A測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程包MeRIP-PF,用于快速分析大規(guī)模m6A測(cè)序數(shù)據(jù),并采用MeRIP-seq測(cè)序技術(shù),開(kāi)展了水稻多組織RNA m6A修飾譜的比較研究,彌補(bǔ)了m6A在植物尤其是水稻中的研究空白,為水稻的RNA表觀(guān)修飾研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S511
【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
專(zhuān)業(yè)詞匯中英文對(duì)照表
1 引言
    1.1 RNA修飾
    1.2 m6A的發(fā)現(xiàn)及研究歷程
        1.2.1 m6A的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 m6A研究的里程碑事件
    1.3 m6A甲基化/去甲基化及修飾后的調(diào)節(jié)
        1.3.1 m6A甲基化/去甲基化的動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程
        1.3.2 METTL3
        1.3.3 其他相關(guān)基因的研究
    1.4 m6A分布特點(diǎn)及motif研究
        1.4.1 m6A的組織分布特點(diǎn)
        1.4.2 m6A的基因組分布特點(diǎn)
        1.4.3 m6A保守序列的研究
    1.5 m6A生物學(xué)功能
    1.6 m6A檢測(cè)方法及IP-seq技術(shù)概述
        1.6.1 MeRIP-seq技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理
        1.6.2 MeRIP-seq技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法
        1.6.3 單核苷酸分辨率定量檢測(cè)m6A水平
    1.7 調(diào)控種子早期萌發(fā)相關(guān)基因與機(jī)制的研究概述
        1.7.1 種子萌發(fā)
        1.7.2 調(diào)控種子早期發(fā)育的相關(guān)基因與機(jī)制的概述
    1.8 研究?jī)?nèi)容與研究意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)樣品
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
    2.3 MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建
6A抗體的免疫沉淀反應(yīng)'>        2.3.2 基于抗m⁶A抗體的免疫沉淀反應(yīng)
    2.4 數(shù)據(jù)分析方法
        2.4.1 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理
        2.4.2 有效測(cè)序數(shù)據(jù)的序列比對(duì)
        2.4.3 基因定量、差異表達(dá)分析及聚類(lèi)分析
        2.4.4 特定基因的功能分析
        2.4.5 m6A peak的定量及差異分析
        2.4.6 m6A保守序列的搜索與鑒定
3 結(jié)果與討論
    3.1 甲基化區(qū)域的鑒定方法--MeRIP-PF的研發(fā)
        3.1.1 MeRIP-PF方法的原理
        3.1.2 MeRIP-PF性能測(cè)試
        3.1.3 MeRIP-PF與最新方法的比較
    3.2 水稻m6A甲基化修飾譜的基本特征
        3.2.1 6個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)（IP+Input）的基本情況
        3.2.2 水稻中m6A peak的鑒定
        3.2.3 水稻中m6A peak的分布特征
        3.2.4 m6A peak與基因特征、基因表達(dá)的關(guān)系
    3.3 SMG的鑒定及其機(jī)制的探索
        3.3.1 SMG的定義
        3.3.2 SMG的鑒定與功能分析
        3.3.3 SMG相關(guān)機(jī)制的探索
    3.4 水稻種子萌發(fā)早期基因表達(dá)與m6A修飾的關(guān)系
        3.4.1 種子萌發(fā)早期的共表達(dá)基因的聚類(lèi)分析
        3.4.2 共表達(dá)基因的功能分析
        3.4.3 種子萌發(fā)早期重要調(diào)控基因m6A的動(dòng)態(tài)變化
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A
附錄B
作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

【參考文獻(xiàn)】

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1 李語(yǔ)麗;于軍;宋述慧;;RNA中6-甲基腺嘌呤的研究進(jìn)展[J];遺傳;2013年12期

2 Yuli Li;Shuhui Song;Cuiping Li;Jun Yu;;MeRIP-PF:An Easy-to-use Pipeline for High-resolution Peak-finding in MeRIP-Seq Data[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2013年01期

本文編號(hào)：2856184