發(fā)布時(shí)間：2020-10-29 22:08

　　 家蠶質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)病,是家蠶的一種腸道型病毒病,在養(yǎng)蠶生產(chǎn)上具有較大的危害性,病原是一種具包涵體的多角體病毒。研究家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的microRNA(miRNA)和RNA干涉(RNA Interfering,RNAi),一方面從miRNA途徑探明病毒與宿主的免疫調(diào)控關(guān)系,從而找到miRNAs調(diào)控病毒的靶點(diǎn);另一方面探索RNAi干擾病毒復(fù)制的可行性,對(duì)于家蠶病毒病的分子治療乃至抗病品種的育成具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究預(yù)測(cè)了BmCPV編碼的miRNAs,對(duì)其中的兩條進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、鑒定和表達(dá)特征檢測(cè),初步探索了對(duì)病毒本身基因表達(dá)的影響;同時(shí)研究了雙鏈短RNA(簡(jiǎn)稱(chēng)dsRNA)對(duì)BmCPV-RDRP基因的干擾作用,構(gòu)建了表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體。通過(guò)本文研究,為進(jìn)一步探索miRNAs與家蠶基因組互作的關(guān)系,miRNAs影響宿主的基因的表達(dá),miRNAs與BmCPV病毒各分節(jié)基因相互作用的細(xì)致研究等提供重要的參考價(jià)值,同時(shí)也為培育抗BmCPV家蠶品種提供了技術(shù)依據(jù)�，F(xiàn)將研究匯報(bào)如下。1.BmCPV能夠編碼miRNAs。對(duì)感染BmCPV的家蠶中腸組織提取總小RNA,通過(guò)深度測(cè)序建立了小RNA文庫(kù),預(yù)測(cè)獲得BmCPV編碼的miRNAs。對(duì)其中的兩條miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析、驗(yàn)證和表達(dá)特征檢測(cè)。表明兩條miRNA分別為BmCPV基因組RNA第三片段編碼的miR-3(478~497 bp)和第五片段編碼的miR-5(2481~2500bp),大小均為20 bp;在線分析繪制了其二級(jí)結(jié)構(gòu)和3-D結(jié)構(gòu);Stem-loop RT-qPCR和Northern blot兩種方法驗(yàn)證,確認(rèn)了兩條miRNAs的存在;表達(dá)特征檢測(cè)進(jìn)一步表明,miR-3表達(dá)量相對(duì)較多而miR-5表達(dá)較少,家蠶感染BmCPV 5 h后能檢測(cè)到病毒編碼的miRNAs,24 h后表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。研究結(jié)果表明BmCPV能夠編碼miRNA,為進(jìn)一步深入研究BmCPV編碼的miRNAs及其功能奠定了基礎(chǔ)。2.BmCPV編碼的miRNAs對(duì)病毒本身基因表達(dá)具有調(diào)控作用。家蠶感染病毒后體腔注射過(guò)量miR和Inhibition-miR,RT-qPCR檢測(cè)病毒基因表達(dá),結(jié)果顯示,過(guò)量miR能夠顯著促進(jìn)病毒部分基因表達(dá)。3.dsRNA對(duì)BmCPV-RDRP基因的干擾作用。以家蠶質(zhì)型多角體病毒依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶(BmCPV-RDRP)基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)合成三條dsRNA序列,家蠶幼蟲(chóng)感染病毒后體腔注射dsRNA,RT-PCR檢測(cè)靶基因表達(dá)。每頭5齡蠶注射4~6 ng/mg劑量的dsRNA,能夠干擾BmCPV-RDRP基因的表達(dá);注射dsRNA后感染病毒的處理區(qū)干擾效率可達(dá)93%,而注射dsRNA前感染病毒的干擾效率可達(dá)99.9%;同時(shí),檢測(cè)BmCPV的二個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因片段(S1、S5),其表達(dá)水平隨著RDRP基因表達(dá)水平降低而降低,推測(cè)dsRNA干擾BmCPV-RDRP基因表達(dá)能夠影響病毒的增殖。4.構(gòu)建了表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體�？寺〖倚Q中腸特異性啟動(dòng)子P2,構(gòu)建了中間表達(dá)載體PBM-P2-dsRNA-eGFP,家蠶細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測(cè),結(jié)果表明啟動(dòng)子P2能夠表達(dá)dsRNA而形成shRNA(small hairpin RNA);以P2-dsRNA序列為目的基因,基于piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建獲得表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體pig-P2-dsRNA-ploy(A)-eGFP-neo,家蠶細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測(cè)表明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體能夠表達(dá)dsRNA。
【學(xué)位單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S884.52
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 BmCPV研究進(jìn)展
    1.2 家蠶抗BmCPV研究進(jìn)展
    1.3 miRNAs概述
    1.4 病毒編碼的miRNA研究進(jìn)展
    1.5 RNAi抗病毒研究進(jìn)展
    1.6 本文主要內(nèi)容
第二章 一般材料與方法
    2.1 一般材料
        2.1.1 生物材料
        2.1.2 工具酶和所用相關(guān)試劑盒
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 核酸引物和測(cè)序
        2.1.5 試劑配置
        2.1.6 常用儀器
    2.2 常用方法
        2.2.1 制備感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.2 DNA連接的反應(yīng)體系
        2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.4 重組質(zhì)粒的篩選
        2.2.5 采用堿裂解法來(lái)制備少量質(zhì)粒DNA
        2.2.6 DNA目的片段分離和回收
        2.2.7 PCR擴(kuò)增技術(shù)
        2.2.8 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.9 提取總RNA
        2.2.10 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.2.11 定量PCR（Quantitative PCR）
第三章 BmCPV編碼miRNA的分析和鑒定
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗(yàn)材料
        3.2.2 試驗(yàn)方法
    3.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 從感染BmCPV家蠶中腸小RNA文庫(kù)中預(yù)測(cè)miRNAs
        3.3.2 BmCPV的miRNA生物信息學(xué)分析
        3.3.4 miR靶基因的預(yù)測(cè)
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
第四章 BmCPV-miRNA對(duì)病毒本身基因表達(dá)調(diào)控研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 試驗(yàn)材料
        4.2.2 試驗(yàn)方法
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 miR-3 和Inhibition-miR-3 對(duì)BmCPV基因表達(dá)的影響
        4.3.2 miR-5 和Inhibit-miR-5 對(duì)BmCPV基因表達(dá)的影響
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第五章 dsRNA干擾BmCPV-RDRP基因表達(dá)研究
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 試驗(yàn)材料
        5.2.2 試驗(yàn)方法
    5.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.3.1 BmCPV-RDRP基因表達(dá)特征
        5.3.2 BmCPV基因檢測(cè)引物的驗(yàn)證
        5.3.3 注射液在家蠶體腔內(nèi)擴(kuò)散的模擬實(shí)驗(yàn)
        5.3.4 dsRNA對(duì)BmCPV-RDRP的干擾效果
        5.3.5 BmCPV-RDRP基因抑制后對(duì)病毒基因組其它片段表達(dá)的影響
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的表達(dá)dsRNA轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及檢測(cè)
    6.1 引言
    6.2 材料和方法
        6.2.1 試驗(yàn)材料
        6.2.2 試驗(yàn)方法
    6.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析
        6.3.1 Bm-P2啟動(dòng)子的克隆和在線分析
        6.3.2 中間載體Bm-P2-dsRNA構(gòu)建及表達(dá)效果檢測(cè)
        6.3.3 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)
    6.4 討論
    6.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和成果
致謝
附錄一 Abbreviations list


本文編號(hào)：2861523