發(fā)布時間：2020-11-20 01:10

　　 為研制農藥特異性基因工程抗體,本研究以有機磷殺蟲劑三唑磷和對硫磷為目標分析物,采用一種新型水溶性免疫佐劑(快速佐劑)進行了三唑磷和對硫磷單克隆抗體(單抗)的制備。該免疫佐劑操作簡便,無需乳化,與人工抗原混合后可直接對Balb/c小鼠進行小腿肌肉注射,免疫脾細胞制備方便,細胞融合后篩選得到有效細胞株的陽性率超過30%;間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ic-ELISA)篩選獲得能夠穩(wěn)定分泌高親合力、高特異性抗體的雜交瘤細胞株,快速制備了針對農藥三唑磷和對硫磷的高親合力單抗,靈敏度和特異性等方面與以往采用弗氏佐劑獲得的單抗相當,對三唑磷的識別靈敏度(IC50)0.91 ng/mL,對對硫磷識別靈敏度(IC50)8.18ng/mL。以制備的雜交瘤細胞株為RNA來源,采用抗體亞型特異性的簡并性引物,通過RT-PCR法擴增了抗對硫磷單抗的y1亞型重鏈可變區(qū)(VH)和κ亞型輕鏈可變區(qū)(VL)的基因序列,以及抗三唑磷單抗的γ1亞型VH和稀有的λ亞型VL基因序列,通過重疊延伸PCR法成功將相應的VH、VL核苷酸序列經連接肽(Gly4Ser)3串聯(lián),構建了 VH-VL連接方式的單鏈抗體(scFv)全長序列。將抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv的全長序列依次構建到大腸桿菌原核表達體系、桿狀病毒-昆蟲細胞表迗系統(tǒng)、畢赤酵母真核表達系統(tǒng)中進行可溶性表達,免疫印跡法鑒定蛋白表達,ic-ELISA法評價抗體活性。結果表明,抗三唑磷抗體和抗對硫磷抗體的VH和VL基因序列被成功擴增,在畢赤酵母表達體系中更經濟有效地獲得了高活性的抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv,抗體活性與親本單抗相當,為進一步展開新型抗體的分子設計奠定了研究基礎。在明確表達體系的基礎上,研究了輕重鏈可變區(qū)取向(VH-VL、VL-VH)對抗三唑磷scFv、抗對硫磷scFv的生物活性和表達水平的影響。結果表明,輕重鏈可變區(qū)不同取向對抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv的親合力和特異性沒有明顯影響,產物具備特異性識別相應靶標化合物的能力,對三唑磷的IC50在0.4～0.5 ng/mL,對對硫磷IC50在8.5～10.5ng/mL,抗體活性與親本單抗相當;相較而言,抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv在VL-VH取向下,更容易獲得較高水平的蛋白表迗,表達量均迗700mg/L左右。隨后,嘗試了兩個抗三唑磷scFv的串聯(lián),設計了不同輕重鏈可變區(qū)取向和連接肽長度的抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體,ic-ELISA法鑒定不同抗體的活性。結果表明,抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體的抗體活性與連接肽長短[Gly4Ser、(Gly4Ser)3]、單價scFv的表達情況無關,與輕重鏈取向有關,輕鏈在N端的構建方式更易獲得高識別能力的抗體蛋白,親合力(IC50在0.8～0.9 ng/mL)和特異性與親本單抗相當。在上述研究基礎上,設計了不同連接方式的三唑磷-對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體。ic-ELISA法鑒定結果表明,輕重鏈可變區(qū)取向同樣是影響三唑磷及對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體識別能力的重要因素。其中,以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的構建方式更容易獲得高識別能力的抗體,但對三唑磷和對硫磷的靈敏度均下降了近7倍,同時交叉識別譜發(fā)生了改變。綜上所述,在構建高親合力單鏈抗體、雙價串聯(lián)單鏈抗體以及雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時,應優(yōu)先考慮輕鏈可變區(qū)在N端的構建方式;在設計雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時,還需要考慮兩個scFv可變區(qū)片段之間的相互干擾導致抗體活性下降和非特異性結合的問題。最后,利用Accelrys公司的Discovery studioTM,根據(jù)抗體的氨基酸序列進行同源模建,構建了抗三唑磷單鏈抗體和抗對硫磷單鏈抗體的三維模型。對抗體與農藥小分子間的對接構象進行了模擬,確定了對接過程中抗體的主要氨基酸作用位點。同時,結合表面等離子共振技術(SPR)測定抗體與小分子互作反應,明確了抗體與靶分子間結合的動力學和親合能力,為進一步提高抗體的親合力以及穩(wěn)定性奠定了堅實的基礎。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：TQ450.1;Q78
【部分圖文】：

抗體的制備難度遠遠大于大分子材料。??目前，半抗原特異性單克隆抗體的來源主要有鼠源和兔源［３４－３６］。其中，報??道最多的是通過免疫小鼠制備單克隆抗體，其流程如圖１－２所示�？乖�免疫動??物的過程是制備單克隆抗體的第一步，也是直接關系到能否獲得所需要的具有??一定特異性的單克隆抗體的重要開端［３７１。半抗原的結構對免疫應答反應的具有??一定影響，但免疫佐劑在該過程中同時發(fā)揮了不可忽視的重要作用，尤其是??弱免疫原性的抗原，免疫佐劑是促進其產生性能良好的單克隆抗體的關鍵因素??之一。理想化的免疫佐劑，應對不同免疫原性的抗原均產生輔助增強作用，??即便是對弱免疫原性的抗原亦應如此，在輔助產生具備良好性能抗體的同時，??也需考慮動物福利，減少炎癥或疼痛等不適感產生。據(jù)報道，在小分子化合物??單克隆抗體上應用的免疫佐劑主要有弗氏佐劑和ＧＥＲＢＵＰ７］，ＴｉｔｅｒＭａｘ佐劑??單礎醜基脂質Ａ佐劑Ｗ

ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＨ）和輕鏈的?Ｖ?區(qū)（ｌｉｇｈｔ?ｃｈａｉｎ?ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＬ）共同形成了??與抗原結合的區(qū)域，較錯區(qū)則保證了抗體分子在和結合抗原時較大的彈性。如??圖１－３?Ｂ，根據(jù)氨基酸變異程度，Ｖ區(qū)可再劃分為３個超變區(qū)或互補決定區(qū)??（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｈｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，?ＣＤＲ），此區(qū)域是抗體結合特異性抗原的??部位，化是獨特型決定簇的位點；而分隔開的４個區(qū)域被稱為框架區(qū)??（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＦＲ），組成了可變區(qū)穩(wěn)定的立體結構［６８］，而抗體可變區(qū)氨??基酸的多樣性使得獲得具有不同結合抗原特異性的抗體成為了可能。同時，隨??著抗體基因結構的解析和闡明，基因工程技術開始應用于抗體的分子設計和改??造，多種構建模式和表這體系被應用于重組抗體的制備，使得天然抗體的一些??７??

ｆｒａｇｍｅｎｔ?（ｓｃＦｖ）?ａｎｄ?ｄｓＦｖ??單域（單區(qū)）抗體（ｓｉｎｇｌｅ?ｄｏｍａｉｎ?ａｎ化ｏｄｙ，?ｓｄＡｂ），又稱納米抗體（ｎａｎｏｂｏｄｙ）??或重鏈抗體，是從駱駝科動物和１魚的血清中分離出的一種抗體，如圖１－５所??示，其體積約為傳統(tǒng)抗體的１／１２，并且這些重鏈抗體的親合為與傳統(tǒng)抗體分子??相當，因此同樣具有很強的抗原結合能為。另外很早就已有報道，傳統(tǒng)抗體分??子中抗原與抗體的結合并非需要整個抗體分子各部分的參與，在一些情況下，??僅僅需要一條重鏈或是輕鏈即可，通常更傾向于認為單獨的ＶＨ可レ乂保留相當??程度的抗原結合能為，其作用一般比ＶＬ大。因此，單域（單區(qū)）抗體亦指這??些單獨存在即能具有相當?shù)目乖�結合能為的ＶＨ或ＶＬ單功能結構域分子，分??子量小、免疫原型低、不需ＶＨ和ＶＬ的棲互作用，具有相當?shù)目乖�親合性能，??正逐級成為一個研究的熱點方向
【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 Rui LIU;Ying LIU;Mei-jing LAN;Niusha TAHERI;Jing-li CHENG;Yi-rong GUO;Guo-nian ZHU;;一種水溶性免疫佐劑應用于小分子化合物單克隆抗體制備的效果評價（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2016年04期

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本文編號：2890710