發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 02:35

　　 家蠶最具特色和被人類廣泛利用的價(jià)值是高效生產(chǎn)絲蛋白質(zhì)纖維。絲腺是家蠶高度特化的專一合成和分泌絲蛋白的器官,是人類馴化和選擇家蠶的主要對(duì)象。提高絲腺的蛋白質(zhì)合成與分泌效率,改良絲腺合成的蛋白質(zhì)纖維成分是養(yǎng)蠶業(yè)世界矚目的重大課題。伴隨家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟,有效利用絲腺超強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成能力生產(chǎn)外源蛋白,成為生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域熱門課題；家蠶作為中國(guó)特色的模式動(dòng)物研究,在農(nóng)業(yè)昆蟲的模式應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)的無(wú)脊椎動(dòng)物替代領(lǐng)域也備受業(yè)者關(guān)注。本文研究了一種轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺突變表型與機(jī)制,主要結(jié)果如下：1.通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了家蠶后部絲腺發(fā)育突變體TBH本文設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)3057 bp的Fib-H相似編碼序列Hpl (Fib-H-like gene),通過Piggybac轉(zhuǎn)座子將Hpl轉(zhuǎn)入到家蠶基因組,篩選獲得了后部絲腺(PSG)特異表達(dá)Hpl的突變體TBH(hpl/hpl)。經(jīng)mRNA及蛋白水平檢測(cè),外源基因Hpl在PSG成功表達(dá)。TBH幼蟲期的前部絲腺(ASG)與中部絲腺(MSG)發(fā)育正常,而PSG長(zhǎng)度顯著短于野生型,PSG直徑變粗且透光性降低、折疊數(shù)減少、出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)“念珠”狀卷曲,且細(xì)胞核排列由野生型的樹突分支狀變得雜亂無(wú)章。TBH成熟幼蟲吐絲量減少,化蛹過程中裸蛹及半化蛹個(gè)體比例顯著增高。2.降低內(nèi)源絲素基因的表達(dá)能夠提高外源重組蛋白在后部絲腺中的表達(dá)量TBH個(gè)體中,內(nèi)源的Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)合成及分泌水平?jīng)]有下降,而Fib-H的：mRNA水平降低了71.1%；分泌的絲素蛋白中,Fib-H的比例從野生型的91.86%降至71.01%。外源重組基因Hpl的mRNA水平雖然分別只有Fib-H和Fib-L的0.73‰和0.74‰,而HPL蛋白占絲素蛋白和分泌蛋白總量的量高達(dá)18.85%和15.46%,非常高效地翻譯和分泌了外源大分子蛋白HPL。進(jìn)一步對(duì)PSG細(xì)胞DEGs分析,檢測(cè)到891個(gè)DEGs。TBH的PSG細(xì)胞中,不僅與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)的239個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,應(yīng)激和細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)反應(yīng)相關(guān)的37個(gè)基因也受到顯著影響。顯示TBH系統(tǒng)在Fib-H轉(zhuǎn)錄被下調(diào)的同時(shí),非常顯著地提高了外源重組蛋白的產(chǎn)量。該結(jié)果對(duì)其他重組蛋白在絲腺中的生產(chǎn)提供了重要的參考意義及優(yōu)化思路。3.后部絲腺發(fā)育異常影響其退化過程中的程序性細(xì)胞死亡進(jìn)程及30K蛋白的正常表達(dá)在幼蟲-蛹變態(tài)過程的絲腺退化期,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因突變體TBH的絲腺HE染色和PCD相關(guān)檢測(cè)表明：TBH的絲腺在退化過程中顯著慢于野生型。PSD中30K蛋白水平檢測(cè)結(jié)果顯示,5齡幼蟲期TBH與野生型家蠶之間無(wú)明顯差異；但絲腺退化過程中,野生型家蠶在絲蛋白質(zhì)合成減速后,提高了30K蛋白水平合成水平,TBH家蠶的絲腺中30K蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平和30K蛋白水平明顯低于野生型。推測(cè)阻遏Fib-H等絲蛋白正常表達(dá),會(huì)導(dǎo)致(后部)絲腺發(fā)育畸形,并進(jìn)一步改變了絲腺退化過程中的PCD與絲腺生理蛋白質(zhì)合成功能的轉(zhuǎn)變,影響30K等蛋白參與的生殖發(fā)育等一系列生理功能,如導(dǎo)致產(chǎn)卵量明顯下降。4.以TBH為材料初步建立高蛋白/氨基酸血癥模型如同高血脂、高血糖對(duì)人類身體的影響,高蛋白或氨基酸血癥對(duì)人體的生命健康同樣具有嚴(yán)重的威脅,但至今還未有高蛋白/氨基酸血癥動(dòng)物疾病模型的報(bào)道。本文的轉(zhuǎn)基因突變體TBH個(gè)體在蛹期血淋巴中的蛋白質(zhì)及游離氨基酸濃度急劇上升,出現(xiàn)6d-7d的高循環(huán)血高蛋白/氨基酸環(huán)境,并誘導(dǎo)TBH家蠶個(gè)體死亡。這是一例窗口期長(zhǎng)占生命周期10%以上的高蛋白/氨基酸血癥模型,提高對(duì)研究高蛋白/氨基酸血癥動(dòng)物組織病變機(jī)制、開發(fā)相關(guān)治療藥物具有重要意義。而且該時(shí)期動(dòng)物(家蠶)不進(jìn)食與活動(dòng),是一個(gè)封閉的生物系統(tǒng),能夠顯著提高相關(guān)研究的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S881.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1 家蠶絲腺的發(fā)育與退化
        1.1 絲腺的發(fā)生與發(fā)育
        1.2 絲腺細(xì)胞的自噬與凋亡
        1.3 絲腺程序性死亡與30K蛋白合成
        1.4 絲腺程序性死亡的研究?jī)r(jià)值
    2 家蠶絲蛋白基因表達(dá)調(diào)控及表達(dá)缺陷絲腺退化模型
        2.1 絲膠蛋白的組成及其基因表達(dá)調(diào)控
        2.2 絲素蛋白的組成及其基因表達(dá)調(diào)控
        2.3 Nd裸蛹系統(tǒng)絲蛋白基因表達(dá)缺陷絲腺退化模型
        2.4 裸蛹系統(tǒng)的開發(fā)利用
    3 家蠶絲腺生物反應(yīng)器研究現(xiàn)狀及優(yōu)化思路
        3.1 絲腺生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)
        3.2 絲腺反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀
        3.3 絲腺生物反應(yīng)器的優(yōu)化方向
    4 高蛋白/氨基酸血癥動(dòng)物模型
        4.1 人類低/高蛋白血癥及其相關(guān)模型
        4.2 家蠶在生物醫(yī)藥及疾病模型研究中的地位
    5 立題依據(jù)與研究?jī)?nèi)容
    6 研究技術(shù)路線
第二章 家蠶后部絲腺轉(zhuǎn)基因突變系統(tǒng)的構(gòu)建及其表型分析
    1 試驗(yàn)動(dòng)物
    2 試驗(yàn)試劑
        2.1 主要試劑
        2.2 主要試劑的配制
        2.3 儀器設(shè)備
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
        3.2 胚胎的顯微注射及轉(zhuǎn)基因個(gè)體篩選
        3.3 石蠟切片的制備
        3.4 HE染色
        3.5 DAPI染色
        3.6 酚/氯仿法基因組DNA抽提
        3.7 反向PCR
        3.8 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.9 DNA回收、純化、測(cè)序及分析
        3.10 后部絲腺總RNA提取
        3.11 總RNA的消化
        3.12 RNA反轉(zhuǎn)錄及SqRT-PCR反應(yīng)
        3.13 蛋白質(zhì)的提取
        3.14 BCA法測(cè)定蛋白濃度
        3.15 Western Blot
    4 試驗(yàn)結(jié)果
        4.1 外源基因Hpl的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)基因突變系統(tǒng)TBH（Hpl/Hpl）的建立
        4.2 突變系統(tǒng)TBH家蠶Hpl基因表達(dá)鑒定
        4.3 TBH家蠶絲腺發(fā)育異常的表型分析
    5 討論與小結(jié)
第三章 降低家蠶內(nèi)源絲蛋白表達(dá)對(duì)外源重組蛋白表達(dá)的影響
    1 試驗(yàn)動(dòng)物
    2 試驗(yàn)試劑
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 總RNA的提取及消化
        3.2 RNA反轉(zhuǎn)錄及SqRT-PCR反應(yīng)
        3.3 實(shí)時(shí)定量PCR
        3.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序（RNA-Seq）
        3.5 繭絲蛋白的提取
        3.6 BCA法測(cè)定蛋白濃度
        3.7 SDS-PAGE
        3.8 蛋白質(zhì)染色
        3.9 Westem Blot
        3.10 繭絲物理性能測(cè)定
    4 試驗(yàn)結(jié)果
        4.1 外源重組蛋白HPL表達(dá)效率
        4.2 TBH與野生型后部絲腺的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因比較
        4.3 TBH繭絲的物理性能
    5 討論與小結(jié)
第四章 突變體TBH家蠶絲腺程序性細(xì)胞死亡過程中30K蛋白的表達(dá)
    1 試驗(yàn)動(dòng)物
    2 試驗(yàn)試劑
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 石蠟切片的制作
        3.2 HE染色及DAPI染色
        3.3 活性氧檢測(cè)
        3.4 蛋白提取及濃度的測(cè)定
        3.5 Western Blot
        3.6 免疫組化
        3.7 DNA Ladder
        3.8 RNA的提取、消化、轉(zhuǎn)錄、半定量與定量PCR及電泳
    4 試驗(yàn)結(jié)果
        4.1 TBH家蠶變態(tài)發(fā)育過程中絲腺退化延遲
        4.2 TBH家蠶后部絲腺退化過程中自噬與凋亡相關(guān)基因表達(dá)
        4.3 TBH家蠶后部絲腺退化過程中相關(guān)蛋白質(zhì)的修飾變化
        4.4 TBH家蠶后部絲腺退化過程中30K蛋白表達(dá)分析
        4.5 TBH絲腺退化過程中的活性氧水平分析
    5 討論與小結(jié)
第五章 高蛋白/高氨基酸血癥家蠶動(dòng)物模型
    1 試驗(yàn)動(dòng)物
    2 試驗(yàn)試劑
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 死亡率統(tǒng)計(jì)方法
        3.2 血清蛋白的提取及測(cè)定方法
        3.3 血清總游離氨基酸樣品的提取方法
        3.4 氨基酸的測(cè)定方法
        3.5 Western Blot
    4 試驗(yàn)結(jié)果
        4.1 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期血淋巴蛋白濃度
        4.2 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期血淋巴游離氨基酸含量
        4.3 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期死亡率
        4.4 高血/高氨基酸血癥對(duì)TBH個(gè)體的生殖影響
    5 討論與小結(jié)
第六章 結(jié)論
    1 論文研究結(jié)論
    2 論文創(chuàng)新點(diǎn)
    3 后續(xù)研究展望與建議
參考文獻(xiàn)
會(huì)議與發(fā)表論文及申請(qǐng)專利
資助項(xiàng)目
攻讀學(xué)位期間參與項(xiàng)目
文中主要縮略詞表
致謝


本文編號(hào)：2893970