發(fā)布時間：2021-02-26 18:18

　　蔗糖作為光合作用的終產(chǎn)物和同化物長距離運(yùn)輸?shù)闹饕�形�?其自源端合成后經(jīng)由韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至庫端需要蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SUT）的參與。同化物在“源”和“庫”之間的流動由“源強(qiáng)”和“庫強(qiáng)”二者共同決定。同化物在不同的庫組織之間的分配決定了各器官的發(fā)育程度和最終產(chǎn)量因素的形成,而蔗糖的運(yùn)輸產(chǎn)生的動力亦可以推動其它光合產(chǎn)物在韌皮部的運(yùn)輸。目前,有研究報道SUT作為蔗糖運(yùn)輸載體,在蔗糖進(jìn)出韌皮部、庫組織蔗糖供給、蔗糖貯存、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控以及其它小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。此外,前人的研究已證實有的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與生長發(fā)育和種子灌漿過程,而關(guān)于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如何影響同化物在庫端的卸載和分配卻鮮有報道。在本研究中,以“日本晴”為材料,利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了OsSUT4基因突變株并對其功能進(jìn)行了探索。根據(jù)OsSUT4的核酸序列（GenBank序列號:AB091673.1）,設(shè)計CDS上的靶標(biāo)并構(gòu)建載體,轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織,經(jīng)分化和再生獲得OsSUT4基因編輯植株。三代以上連續(xù)自交后去除Cas9蛋白的遺傳背景并獲得純合突變體。構(gòu)建OsSUT4-GFP重組質(zhì)粒,并在洋蔥鱗片葉表皮... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 蔗糖的代謝
        1.1.1 蔗糖的生物學(xué)合成
            1.1.1.1 碳的固定
            1.1.1.2 磷酸丙糖輸出葉綠體
            1.1.1.3 蔗糖的合成
        1.1.2 蔗糖的分解
    1.2 蔗糖在植物體內(nèi)的運(yùn)輸
        1.2.1 蔗糖的運(yùn)輸過程
            1.2.1.1 蔗糖在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸
            1.2.1.2 蔗糖在細(xì)胞間的運(yùn)輸過程
        1.2.2 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體
    1.3 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        1.3.1 SUT蛋白的分類
        1.3.2 SUT蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.3.3 SUT蛋白的定位
            1.3.3.1 亞細(xì)胞定位
            1.3.3.2 組織特異性
        1.3.4 SUT蛋白的研究進(jìn)展
            1.3.4.1 質(zhì)膜定位的SUTs
            1.3.4.2 液泡膜定位的SUTs
    1.4 水稻的幼穗發(fā)育
        1.4.1 幼穗發(fā)育的過程
        1.4.2 幼穗發(fā)育的影響因素
        1.4.3 糖分供應(yīng)與幼穗發(fā)育
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 材料的培養(yǎng)
        2.1.3 菌株與質(zhì)粒
        2.1.4 生化試劑及酶制劑
        2.1.5 耗材
        2.1.6 PCR引物
        2.1.7 培養(yǎng)基
        2.1.8 分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        2.2.2 質(zhì)粒提取
        2.2.3 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.4 凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
        2.2.5 水稻愈傷組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化
            2.2.5.1 愈傷組織誘導(dǎo)
            2.2.5.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)
            2.2.5.3 根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)
            2.2.5.4 愈傷組織轉(zhuǎn)化-預(yù)培養(yǎng)
            2.2.5.5 愈傷組織轉(zhuǎn)化-侵染
            2.2.5.6 愈傷組織轉(zhuǎn)化-共培養(yǎng)
            2.2.5.7 愈傷組織轉(zhuǎn)化-篩選培養(yǎng)
            2.2.5.8 愈傷組織轉(zhuǎn)化-抗性愈傷組織再分化
            2.2.5.9 愈傷組織轉(zhuǎn)化-再生苗生根和壯苗
        2.2.6 CRISPR/Cas9基因編輯水稻的DNA水平鑒定
            2.2.6.1 SDS法提取水稻基因組DNA
            2.2.6.2 PCR擴(kuò)增并測序
        2.2.7 p Os SUT4::GUS表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.8 基因表達(dá)量檢測
            2.2.8.1 水稻總RNA提�。═RIZOL試劑法）
            2.2.8.2 RNA瓊脂糖變性凝膠電泳檢測
            2.2.8.3 RNA濃度測定
            2.2.8.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.2.8.5 c DNA質(zhì)量檢測
            2.2.8.6 實時熒光定量PCR
        2.2.9 Os SUT4瞬時表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.10 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化
        2.2.11 Os SUT4抗體制備
            2.2.11.1 Os SUT4人工多肽抗體制備
            2.2.11.2 GST- Os SUT4重組蛋白表達(dá)
            2.2.11.3 GST-Os SUT4重組蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.11.4 SDS-PAGE電泳
            2.2.11.5 考馬斯亮藍(lán)凝膠染色
            2.2.11.6 GST-Os SUT4重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.11.7 GST- Os SUT4重組蛋白純化
            2.2.11.8 蛋白濃度測定
            2.2.11.9 重組蛋白免疫家兔
        2.2.12 Western blot
            2.2.12.1 水稻全蛋白提取
            2.2.12.2 SDS-PAGE電泳
            2.2.12.3 濕法轉(zhuǎn)膜
            2.2.12.4 封閉
            2.2.12.5 免疫反應(yīng)
            2.2.12.6 ECL化學(xué)發(fā)光
        2.2.13 掃描電鏡樣品制備
        2.2.14 水稻生理指標(biāo)測定
            2.2.14.1 蔗糖含量測定
            2.2.14.2 葡萄糖含量測定
            2.2.14.3 果糖含量測定
            2.2.14.4 淀粉含量測定
        2.2.15 光合作用相關(guān)參數(shù)測定
2同化速率的測定">            2.2.15.1 水稻葉片CO₂同化速率的測定
            2.2.15.2 水稻葉片葉綠素?zé)晒鈪��?shù)的測定
            2.2.15.3 水稻葉片P700還原態(tài)的測定
            2.2.15.4 葉綠素含量測定
        2.2.16 水稻生物量測定
        2.2.17 GUS染色
13CO₂標(biāo)記">        2.2.18 穩(wěn)定同位素¹³CO₂標(biāo)記
        2.2.19 糖分輸出試驗
        2.2.20 水稻農(nóng)藝性狀統(tǒng)計和稻米品質(zhì)分析
        2.2.21 Os SUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測
            2.2.21.1 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.21.2 乙酸鋰法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.21.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            2.2.21.4 酵母體系蔗糖吸收活性測定
            2.2.21.5 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的質(zhì)子依賴性測定
            2.2.21.6 蔗糖吸收動力學(xué)測定
        2.2.22 轉(zhuǎn)錄組測序
3 結(jié)果與分析
    3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得ossut4突變體
        3.1.1 Cas9/g RNA-Os SUT4載體構(gòu)建
        3.1.2 ossut4突變體的獲得
        3.1.3 ossut4突變體的鑒定
        3.1.4 ossut4突變體互補(bǔ)株系的獲得與鑒定
    3.2 Os SUT4蛋白的亞細(xì)胞定位
    3.3 Os SUT4的組織表達(dá)特異性
        3.3.1 GUS染色
        3.3.2 實時熒光定量PCR檢測Os SUT4表達(dá)量
        3.3.3 Os SUT4的表達(dá)受蔗糖誘導(dǎo)
    3.4 Os SUT4影響水稻幼穗發(fā)育
        3.4.1 幼穗發(fā)育狀態(tài)滯后于野生型
        3.4.2 幼穗分化初期突變體幼穗中糖分含量不足
        3.4.3 幼穗分化初期突變體幼莖中糖分過量積累
        3.4.4 幼穗分化初期突變體中同化物分配失衡
        3.4.5 幼穗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)情況
    3.5 Os SUT4影響水稻產(chǎn)量
        3.5.1 稻穗變短、一次枝梗減少
        3.5.2 小區(qū)實際產(chǎn)量減少
        3.5.3 其它性狀統(tǒng)計
    3.6 Os SUT4影響水稻營養(yǎng)生長
        3.6.1 幼苗生長受抑制
        3.6.2 成苗營養(yǎng)器官生長不足
        3.6.3 突變體水稻生物量積累減少
        3.6.4 ossut4突變體貪青晚熟
    3.7 Os SUT4影響水稻灌漿
        3.7.1 ossut4突變體灌漿周期延長
        3.7.2 ossut4突變體糙米品質(zhì)下降
        3.7.3 ossut4-6 突變體中Os GBSSⅠ 活性增強(qiáng)
        3.7.4 Os SUT4影響灌漿期內(nèi)莖稈中非結(jié)構(gòu)性碳的代謝
    3.8 Os SUT4不影響光合產(chǎn)物合成
2同化速率與野生型無差異">        3.8.1 成熟前突變體的CO₂同化速率與野生型無差異
        3.8.2 PSⅡ 和PSⅠ 的活性均未受影響
    3.9 轉(zhuǎn)錄組分析
4 討論
    4.1 Os SUT4影響水稻營養(yǎng)生長
    4.2 Os SUT4影響水稻幼穗發(fā)育
    4.3 Os SUT4影響水稻產(chǎn)量
    4.4 Os SUT4影響稻米品質(zhì)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]超表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsSUT1對水稻形態(tài)和生理的影響[J]. 馮冰,孫雅菲,艾昊,劉秀麗,楊晶,劉璐,高飛燕,徐國華,孫淑斌.  中國水稻科學(xué). 2018(06)
[2]水稻幼穗-穎花發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 姜樹坤,張喜娟,王嘉宇,張鳳鳴.  植物遺傳資源學(xué)報. 2012(06)
[3]C4水稻,我們的新挑戰(zhàn)（英文）[J]. 李圓圓,張慧,朱新廣.  植物生理學(xué)報. 2011(12)
[4]水稻幼穗發(fā)育過程的掃描電鏡觀察——Ⅰ、不同粒位小穗分化進(jìn)度的差異與籽粒性狀的關(guān)系[J]. 陳國珍,孔憲揚(yáng).  作物學(xué)報. 1987(02)



本文編號：3052977