發(fā)布時(shí)間：2018-01-03 13:09

  本文關(guān)鍵詞：卡馬拉素抑制腎上腺皮質(zhì)癌的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical cacinoma,ACC)是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤,占所有惡性腫瘤的0.01%-0.02%。雖發(fā)病率低,但ACC惡性程度高,侵襲性強(qiáng),起病隱匿,預(yù)后差,大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已出現(xiàn)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,五年平均生存率低于30%,其治療仍以根治手術(shù)為主,但對(duì)于轉(zhuǎn)移及進(jìn)展型ACC缺乏有效的藥物治療手段�，F(xiàn)有的以米托坦為核心藥物的化療方案存在有效率低毒副作用大的缺點(diǎn)。因此,對(duì)ACC新藥物的研究變得尤為重要�？�馬拉素(rottlerin)是一種提取自楸樹(shù)的植物多酚,印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其當(dāng)做抗絳蟲(chóng)藥物。最新研究表明,卡馬拉素具有抗腫瘤活性,這種抗腫瘤作用是通過(guò)多通路多機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的,其中包括對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制。而Wnt/β-catenin通路與ACC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究嘗試在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明卡瑪拉素對(duì)ACC皆具有抗腫瘤活性,并初步探討其可能的抗腫瘤機(jī)制,以為ACC的治療提供更有效更安全的化療藥物。材料和方法1.體外實(shí)驗(yàn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證卡馬拉素對(duì)ACC細(xì)胞株((NCI-H295R和SW-13)的增殖具有抑制作用,且這種抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴(lài)的特點(diǎn)。Annexin V-PI染色法及AO/EB染色法證明卡馬拉素可促進(jìn)ACC細(xì)胞株的凋亡,且濃度越高,凋亡促進(jìn)作用越強(qiáng)。流式細(xì)胞儀分析卡馬拉素對(duì)ACC細(xì)胞周期的影響。TRANSWELL實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明卡馬拉素對(duì)ACC細(xì)胞的遷移和侵襲作用具有抑制作用。WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)rottlerin可抑制ACC細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)20只(性別不限)4周齡BALB/C nu/nu裸鼠皮下注射SW-13細(xì)胞構(gòu)筑ACC移植瘤模型,待移植瘤長(zhǎng)徑增長(zhǎng)至約4mm時(shí)將裸鼠隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、DMSO組、Rottlerin 4 mg/kg組以及Rottlerin 2 mg/k g組,每組5只),每日予以腹腔注射,持續(xù)4周,每日1次,對(duì)照組注射0.5ml生理鹽水/只/日,DMSO組注射0.45ml+0.05ml DMSO/只/日,Rottlerin 4 mg/kg組及Rottlerin 2 mg/k g組按照裸鼠體重給予卡馬拉素溶液注射。每4天測(cè)量1次裸鼠移植瘤大小并監(jiān)測(cè)裸鼠體重。4周后處死裸鼠,剝離移植瘤,制成石蠟切片,予以HE染色,觀察成瘤情況,用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卡馬拉素在移植瘤細(xì)胞的凋亡情況。并對(duì)各組的腫瘤切片進(jìn)行β-catenin、LRP6及p-LRP6的免疫組化染色,驗(yàn)證卡馬拉素可在體內(nèi)抑制ACC細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)。結(jié)果1.卡馬拉素可在體外抑制ACC細(xì)胞的增殖,且這種抑制作用具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性,48h IC50分別為NCI-H295R:5.02μM、SW-13:4.87μM�？�馬拉素在體外可促進(jìn)ACC細(xì)胞的凋亡,經(jīng)2.5μM卡馬拉素處理48小時(shí)后,NCI-H295R和SW-13細(xì)胞的凋亡率達(dá)到13.0%和10.9%,這一比例在5μM組中為43.3%和38.3%,顯著高于正常對(duì)照組。AO/EB實(shí)驗(yàn)結(jié)果不但驗(yàn)證了這一結(jié)論,也從形態(tài)學(xué)上證明卡馬拉素可促進(jìn)ACC細(xì)胞的凋亡。2.經(jīng)5μM卡馬拉素處理48小時(shí)的ACC細(xì)胞發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯,G1期細(xì)胞比例分別為NCI-H295R:85.14%、SW-13:81.88%,顯著高于對(duì)照組(p0.05)。TRANSWELL實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)5μM處理24h后ACC細(xì)胞的遷移能力明顯下降,遷移細(xì)胞數(shù)以及遷移率顯著低于對(duì)照組(p0.05)。3.WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)卡馬拉素可在體外抑制ACC細(xì)胞中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)。在經(jīng)過(guò)2.5μM,5μM,10μM卡馬拉素處理48小時(shí)后這3種蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降,且隨著藥物濃度的升高,抑制作用越明顯。4.Rottlerin可抑制裸鼠ACC移植瘤的生長(zhǎng)。經(jīng)腹腔注射藥物4周后,4個(gè)組的裸鼠皆存活,未觀察到明顯毒副反應(yīng),且體重?zé)o顯著差異。腫瘤平均大小分別為:對(duì)照組3.23 cm3,DMSO組3.35 cm3,rottlerin 4 mg/kg組1.56 cm3,rottlerin 4 mg/kg組1.94 cm3。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示卡馬拉素可以促進(jìn)ACC細(xì)胞的凋亡,在TUNEL法染色的腫瘤切片中,注射卡馬拉素的裸鼠腫瘤切片中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組及DMSO組(p0.05),且rottlerin 4 mg/kg組裸鼠腫瘤切片中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著多于rottlerin 2mg/kg組(p0.05)。免疫組化染色結(jié)果提示在rottlerin 4 mg/kg組及rottlerin2mg/kg組中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)量較對(duì)照組和DMSO組顯著下降(p0.05),且rottlerin 4 mg/kg組中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)量顯著低于rottlerin 2 mg/kg組(p0.05)。結(jié)論卡馬拉素在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能夠抑制ACC細(xì)胞的增殖,凋亡,使其發(fā)生細(xì)胞G0/G1期阻滯,抑制ACC細(xì)胞的遷移及侵襲能力,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射卡馬拉素4周的裸鼠未出現(xiàn)明顯毒副作用,卡馬拉素可抑制裸鼠ACC移植瘤的生長(zhǎng),且促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡。體外細(xì)胞WB實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤切片免疫組化皆提示卡馬拉素可抑制Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表達(dá)。這些結(jié)果提示卡馬拉素對(duì)ACC具有抗腫瘤作用,這一作用可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)榭�馬拉素有在人類(lèi)中使用的歷史,且未見(jiàn)毒副反應(yīng)的報(bào)道,且本研究又驗(yàn)證了其在裸鼠中未見(jiàn)明顯毒副反應(yīng),故卡馬拉素因?yàn)槠涞投靖弊饔煤洼^高的抗腫瘤活性而成為ACC新的抗腫瘤藥物。
[Abstract]:In vitro and in vivo experiments , the effects of Camarlin on ACC cell cycle were studied . The apoptosis rate of ACC cells in ACC cells was significantly lower than that of control group ( P < 0.05 ) . The expression of 尾 - catenin , LRP6 and p - LRP6 in nude mice was significantly lower than that in control group and DMSO group ( P < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R736.6

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1 朱沂;卡馬拉素抑制腎上腺皮質(zhì)癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1374010