發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 01:00

  本文關(guān)鍵詞：建立CRISPR敲除造血干細(xì)胞CCR5基因治療艾滋病新策略　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：艾滋病是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。目前的主要治療手段是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療,這種手段能夠有效地控制艾滋病,但不能徹底清除潛伏狀態(tài)的HIV病毒,并伴有嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題。因此,科學(xué)家們不得不尋找新的抗艾策略。2007年,德國(guó)醫(yī)療小組將CCR5(C-C chemokine receptor type 5)基因缺陷的造血干細(xì)胞移植給一名患有白血病的艾滋病患者,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)7年的觀察與檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)HIV病毒及相關(guān)癥狀。這一案例提示我們CCR5可能是艾滋病治療的理想靶點(diǎn)。另外,由于造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell,HSC)移植在臨床上得到成熟的應(yīng)用,可以治療多種造血統(tǒng)腫瘤及免疫相關(guān)疾病,這一技術(shù)為基因治療提供了優(yōu)秀的平臺(tái)。因此,本研究擬建立基于造血干細(xì)胞CCR5基因敲除的技術(shù)平臺(tái),并結(jié)合造血干細(xì)胞移植建立功能性治愈艾滋病的新策略。為完成功能性治愈艾滋病的臨床前研究,本文將針對(duì)多方面的內(nèi)容進(jìn)行深入探索。本課題將建立高效特異的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)平臺(tái),對(duì)HSC上的HIV輔助受體基因CCR5進(jìn)行特異性敲除,并利用人源化免疫系統(tǒng)小鼠HIV感染模型初步探索該策略的安全性和有效性。CRISPR系統(tǒng)由兩部分組成:介導(dǎo)識(shí)別的sgRNA(single guide RNA)和負(fù)責(zé)切割的Cas9蛋白。CRIPSR具有切割效率高和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),本文需要針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA即可,Cas9蛋白則是通用的。首先在細(xì)胞系中篩選出具有高效切割能力、靶向CCR5基因的CRISPR/sgRNA;然后利用免疫缺陷小鼠模型驗(yàn)證該基因編輯體系的安全性和有效性;通過(guò)HIV攻毒實(shí)驗(yàn)該策略對(duì)HIV病毒感染的抵御能力;最后,針對(duì)臨床前研究的需求從多方面檢測(cè)該基因編輯體系的常規(guī)安全性。本文將得到經(jīng)過(guò)安全性驗(yàn)證的、具有抵抗HIV感染能力的CCR5基因靶向的CRISPR基因修飾體系,為該療法進(jìn)入臨床研究和應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本課題將以CCR5為靶點(diǎn),聯(lián)合CRISPR/Cas9技術(shù)和造血干細(xì)胞移植治療方案,建立功能性治愈艾滋病的新策略,以期建立一種更為安全和有效的艾滋病治療技術(shù)。首先,本文中設(shè)計(jì)和構(gòu)建多個(gè)靶向CCR5基因的gRNA表達(dá)載體,建立高度純化、無(wú)內(nèi)毒素Cas9和gRNA載體,建立導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)方法以及靶基因誘變效率檢測(cè)系統(tǒng)。其次,優(yōu)化人造血干/祖細(xì)胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells,HSPCs)的分離純化方案。另外,建立造血干細(xì)胞基因敲除及效率檢測(cè)平臺(tái)。然后,基于免疫缺陷小鼠優(yōu)化人源化動(dòng)物模型,建立具有高度造血系統(tǒng)人源化的小鼠模型以及HIV病毒感染與檢測(cè)技術(shù)體系。接下來(lái),篩選出誘變效率高、特異性好、可賦予細(xì)胞HIV-1抗性的CCR5靶向CRISPR。最后,在CCR5誘變?cè)煅�干�?xì)胞移植小鼠模型上檢測(cè)評(píng)估對(duì)HIV-1感染的抵抗作用,檢測(cè)病毒載量、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組的差異,并觀察小鼠體內(nèi)CCR5突變細(xì)胞的選擇富集效應(yīng)。本文針對(duì)人CCR5基因設(shè)計(jì)了45個(gè)sgRNA。將CRISPR/Cas9體系所需質(zhì)粒采用核轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)2 3天的培養(yǎng)后提取基因組并PCR擴(kuò)增CCR5基因上的對(duì)應(yīng)修飾片段,用T7E1酶切和測(cè)序的方法檢測(cè)該基因的切割效率。經(jīng)檢測(cè),CRISPR切割效率可以達(dá)到50%左右。選取最優(yōu)的CRISPR進(jìn)行后續(xù)的造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有CRISPER系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,將兩個(gè)gRNA導(dǎo)向Cas9對(duì)靶序列進(jìn)行雙鏈切割,從而提高靶序列的敲除效率。在同一批次的CD34+細(xì)胞中,優(yōu)化后的體系對(duì)CCR5序列的切割效率可高達(dá)32%。本文開展了CCR5基因修飾后的人HSPCs的初步安全性評(píng)價(jià)。(1)通過(guò)軟瓊脂培養(yǎng)法檢測(cè)經(jīng)過(guò)基因編輯處理的細(xì)胞是否具有類似于腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的生長(zhǎng)能力,結(jié)果表明修飾后的細(xì)胞與正常細(xì)胞相似,在軟瓊脂懸浮狀態(tài)下不能擴(kuò)增生長(zhǎng)。通過(guò)與對(duì)照組進(jìn)行比較,癌細(xì)胞增殖明顯,而CCR5基因修飾的CD34+細(xì)胞并未出現(xiàn)增殖跡象,證明其不具有體外致瘤性。(2)在裸鼠體內(nèi)成瘤性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到淋巴瘤及其癥狀。(3)通過(guò)染色體核型檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組CCR5基因修飾的CD34+細(xì)胞并未檢測(cè)出核型異常。(4)通過(guò)豚鼠過(guò)敏試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組CCR5基因修飾的CD34+細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)輸注并未出現(xiàn)過(guò)敏癥狀,對(duì)照組輸注BSA的動(dòng)物體內(nèi)均出現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥癥狀。CCR5基因修飾后的CD34+細(xì)胞能夠在免疫缺陷小鼠中重建人的造血細(xì)胞并在其中檢測(cè)到CCR5敲除。修飾后的CD34+HSPCs移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi),8周后開始檢測(cè)移植小鼠的外周血中CD45+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例,分別進(jìn)行8周,10周,12周及16周的定期檢測(cè)。人的CD45細(xì)胞長(zhǎng)期平均重建效率達(dá)40%,最高達(dá)90%。同時(shí)本文在移植后12周的小鼠外周血檢測(cè)到32.2%的CCR5敲除比例。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)CCR5的缺失在具有長(zhǎng)期重建能力的HSC中的比例,本文針對(duì)移植后30 47周的小鼠和二次移植的小鼠進(jìn)行外周血取樣,分別檢測(cè)到31.2%和24.7%。另外,本文成功的實(shí)現(xiàn)了CCR5嗜性的BaL-1毒株在人源化小鼠的長(zhǎng)期、有效的感染。病毒感染的小鼠的病毒載量達(dá)到預(yù)期水平,且保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。為了檢測(cè)該策略在體內(nèi)的抗病毒效果,本文對(duì)移植修飾后的CD34+細(xì)胞12周左右的小鼠進(jìn)行Bal-1病毒感染,在感染后2、4、6、8周檢測(cè)病毒載量變化。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠病毒載量在第8周明顯下降。同時(shí),攻毒前后CD4+T細(xì)胞明顯富集,CCR5敲除比例明顯升高。總之,本文在體外和體內(nèi)水平實(shí)現(xiàn)了高效的CCR5基因敲除。本文通過(guò)在人CD34+細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)CCR5基因高效、特異性敲除。其次,本文將體外修飾的CD34+細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi),能夠高效重建出人的造血系統(tǒng),證明體外修飾策略不會(huì)影響到造血干細(xì)胞的重建能力。另外,在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建的人的外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到CCR5基因敲除,實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)評(píng)價(jià)體系中敲除CCR5基因的目的。此外,本文在體內(nèi)、體外水平完成了常規(guī)性安全實(shí)驗(yàn),初步探索了本策略的安全性。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前,本文對(duì)該治療策略的安全性方面做初步的評(píng)估,提示我們利用CRISPR技術(shù)在CD34+細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)CCR5基因敲除是一種安全的基因修飾方案。人源化小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在小鼠感染R5噬性HIV-1病毒第8周對(duì)照組小鼠病毒載量處于較高水平,而CCR5基因修飾的實(shí)驗(yàn)組小鼠病毒載量明顯下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用CRISPR修飾造血干細(xì)胞CCR5基因重建的人源化小鼠具有抵御HIV-1病毒感染的能力。因此,本研究表明基于CCR5基因敲除治療艾滋病的新策略能夠在體內(nèi)安全、有效的控制HIV病毒的載量,具有轉(zhuǎn)化到臨床研究的重要價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.91

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本文編號(hào)：1376338