發(fā)布時間：2018-01-04 06:09

  本文關鍵詞：Hsp90功能執(zhí)行的動力學分子機制研究及其變構抑制劑發(fā)現(xiàn)　出處：《中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： Hsp90 NMR 動力學 構象調(diào)節(jié) FBDD 抑制劑

【摘要】：Hsp90是分子伴侶蛋白家族的重要成員。它能夠輔助完成客戶蛋白質的結構活化或組裝,維持細胞中蛋白質生成與降解的平衡。目前已經(jīng)明確的Hsp90客戶蛋白達到了~300種,其中包括激素受體、轉錄因子、細胞周期調(diào)控蛋白和激酶等。Hsp90的客戶蛋白質名單中包括了一些著名的癌蛋白,通過調(diào)控與癌癥發(fā)生相關的客戶蛋白質的動態(tài)平衡,Hsp90可在多個途徑、多個環(huán)節(jié)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進程,Hsp90是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱門靶點。Hsp90主要由三個功能結構域構成:N端ATP結合結構域、客戶蛋白質識別結構域(中間結構域)和C端二聚化結構域,而其功能執(zhí)行過程則同時受到內(nèi)源性小分子(ATP、ADP)和內(nèi)源性生物大分子(共伴侶蛋白p23、Cdc37、Aha1等)的精細調(diào)控。Hsp90具有ATP水解酶活性,ATP的結合與水解引發(fā)Hsp90 N端結構域和中間結構域發(fā)生一系列構象變化并最終完成對客戶蛋白質的活化或組裝。ATP結合和水解所引發(fā)的Hsp90的構象變化對于Hsp90整個功能執(zhí)行過程的完成至關重要,然而截至目前為止,我們對于這一過程的了解尚未明晰。鑒于ATP水解酶活性對Hsp90功能執(zhí)行的重要性,ATP結合競爭抑制劑是目前以Hsp90為靶點的抗腫瘤藥物研發(fā)的主攻方向。截至2015年,已有17個靶向Hsp90 N端ATP結合/催化口袋的抑制劑進入臨床實驗階段,然而迄今為止,尚未有相關藥物成功獲批上市,化合物的毒副作用是導致這種結果的最重要原因。開發(fā)靶向Hsp90中間結構域的變構抑制劑有望實現(xiàn)在抑制腫瘤進程的同時規(guī)避相關毒副作用的產(chǎn)生�；�于Hsp90的上述研究現(xiàn)狀,在本論文工作中,我們主要利用NMR實驗技術對ATP依賴的Hsp90的構象變化過程進行探討,嘗試在原子水平闡明Hsp90功能執(zhí)行的動力學分子機制。此外,在結構生物學的研究基礎上使用基于片段的活性化合物發(fā)現(xiàn)技術嘗試獲得靶向Hsp90中間結構域的變構抑制劑,并在分子水平解析這些新型抑制劑的效應機制及其結構基礎,這些抑制劑有可能發(fā)展為毒副作用較小的抗腫瘤藥物。為了闡明ATP依賴的Hsp90 N端結構域構象變化的動力學分子機制,在本論文的第一部分工作中,我們開展了基于核磁共振技術的自由態(tài)Hsp90 N端結構域及其與amppcp(atp類似物)和adp所形成復合物的動力學行為研究。[1h,15n]hsqc滴定實驗、動力學實驗和核磁信號線形分析實驗數(shù)據(jù)顯示:amppcp和adp二者與hsp90的結合模式整體上相類似,然而,它們的結合對介導hsp90n端結構域二聚化的lid片段及其附近區(qū)域(l107-a141:其中l(wèi)id區(qū)域為a111-g135)的影響具有顯著差異:amppcp的結合增強了hsp90lid區(qū)域在?s-ms時間尺度上的慢構象交換運動,而adp的結合使得lid區(qū)域變得更為剛性,與nmr動力學實驗數(shù)據(jù)相一致,itc實驗數(shù)據(jù)顯示hsp90n端結構域和adp的結合過程伴隨熵值減小。依據(jù)核磁共振動力學和itc實驗結果,我們提出了atp/adp依賴的hsp90n端結構域構象轉化的動力學工作模型:在靜息狀態(tài)下,hsp90n端結構域中的lid片段以包括高能“關閉”構象在內(nèi)的多種構象狀態(tài)存在,atp的結合將通過提高lid區(qū)域在?s-ms時間尺度上活動性而增加高能“關閉”構象的占比,在hsp90中間結構域和其它輔因子的進一步幫助下,hsp90n端結構域發(fā)生二聚化,在二聚體中,lid片段區(qū)域以“關閉”構象狀態(tài)存在。在atp水解為adp分子后,hsp90n端結構域的lid片段區(qū)域活動性顯著下降,在溶液中主要以惰性構象存在。在隨后的工作中,我們使用hsp90αnmΔ樣品開展了[1h,15n]hsqc滴定實驗,考察了中間結構域對hsp90n端結構域adp/atp(amppcp)識別結合過程的影響,結果顯示,adp/amppcp與hsp90αnmΔn端結構域和中間結構域的作用模式與adp/amppcp和單獨存在時的n端結構域及中間結構域的作用模式一致。在使用hsp90αnmΔ樣品的情況下,由adp/amppcp結合所引發(fā)的hsp90構象變化主要集中在其n端結構域。在本論文的第二部分工作中,我們開展了靶向hsp90中間結構域的基于核磁共振技術的陽性化合物篩選,獲得了陽性化合物1個(1-e6),隨后,我們使用基于[1h,15n]hsqc滴定實驗的化學擾動分析方法完成了對hsp90中間結構域:1-e6復合物結構的初步表征,并在此基礎上進一步完成了對1-e6的初步結構優(yōu)化,獲得了與hsp90中間結構域的結合強度(結合解離常數(shù)kd)在百?m水平的活性化合物兩個:16-171和16-175。在后續(xù)工作中,我們使用核磁共振技術對兩個活性化合物的分子水平效用機制進行了研究,研究結果顯示,這兩個活性化合物對Hsp90的功能執(zhí)行具有變構調(diào)節(jié)效應,它們與中間結構域的結合導致Hsp90 N端結構域的構象發(fā)生改變,由中間結構域誘導產(chǎn)生的另一種Hsp90 N端結構域穩(wěn)定構象近于完全消失,而16-171和16-175的這種變構調(diào)節(jié)效應不受激活型共伴侶因子Aha1存在與否的影響,但是當另一抑制型共伴侶因子P23存在時,它們施加于Hsp90的變構調(diào)節(jié)效應消失。此外,細胞水平的腫瘤細胞增殖抑制實驗顯示:16-171和16-175具有十?M~百?M水平的人乳腺癌SKBR3細胞生長抑制活性。
[Abstract]:Hsp90 is an important target for the development of Hsp90 . At present , there have been a series of conformational changes in Hsp90 , including hormone receptors , transcription factors , cell cycle regulatory proteins and kinases . In the second part of this thesis , we investigated the effect of the binding process on the domain of the Hsp90n terminal domain . The results showed that the binding process of the two domains of the Hsp90n - terminal domain was significantly different from the experimental data . In the second part of this thesis , we carried out the screening of the positive compounds based on the nuclear magnetic resonance technology of the middle domain of the Hsp90 . However , when another inhibitory copartner factor P23 is present , they are applied to the altered regulatory effect of Hsp90 . In addition , tumor cell proliferation inhibition experiments at cell levels show that 16 - 171 and 16 - 175 have 10 ? M to 100 ? M levels of human breast cancer SKBR3 cell growth inhibitory activity .

【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R91

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