發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 16:36

  本文關(guān)鍵詞：槐定酸類新化合物抗肝癌作用的分子機(jī)理及GSK-3β調(diào)控肝癌的機(jī)制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：槐定堿是從豆科槐屬植物苦豆子中提取分離的一類喹諾里西啶類生物堿,具有抗腫瘤、抗炎等藥理活性。槐定堿作為我國自主研制的1.1類新藥,于2005年被SFDA批準(zhǔn)上市,主要用于絨癌、惡性葡萄胎等惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的治療。在我們長期從中藥中尋找抗腫瘤活性藥物的探索過程中發(fā)現(xiàn),盡管槐定堿具有良好的藥代動力學(xué)性質(zhì)和顯著穩(wěn)定的臨床抗腫瘤療效,但也存在抗瘤譜較窄、具有一定的神經(jīng)毒性等問題。目前,對于槐定堿的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及活性研究仍舊較少。我們將槐定堿的四環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)后,得到一系列三環(huán)槐定酸類衍生物,對其進(jìn)行抗腫瘤活性及作用機(jī)制的初步研究。首先以人肝癌HepG2細(xì)胞為目標(biāo)篩選系,對自主合成的200余個(gè)槐定酸類衍生物進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選,我們發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全性高、抗腫瘤活性好的新衍生物IMB-6G。激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡是很多抗腫瘤藥物的作用機(jī)制,在本部分研究中,我們主要考察IMB-6G是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用。選取人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721為研究對象,首先采用細(xì)胞活力測定、免疫印跡、激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)等多種方法證實(shí)IMB-6G可誘導(dǎo)線粒體依賴性肝癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中的重要分子伴侶GRP78/Bip和促凋亡作用執(zhí)行因子CHOP的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測,WB結(jié)果表明,IMB-6G可時(shí)間和濃度依賴性的升高Bip和CHOP的表達(dá),同時(shí)RT-PCR的結(jié)果表明Bip和CHOP的mRNA的水平也明顯升高,這提示我們IMB-6G可能激活了細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。研究表明,細(xì)胞中CHOP蛋白的表達(dá)升高是PERK-eIF2α途徑激活的直接結(jié)果,我們檢測到IMB-6G作用之后PERK及eIF2α的磷酸化水平均明顯升高,初步證明了 IMB-6G對PERK途徑的激活作用。同時(shí),雙熒光素酶報(bào)告基因的方法也檢測到IMB-6G作用之后CHOP啟動子區(qū)的活性增強(qiáng)。而后siRNA沉默PERK及CHOP的表達(dá),IMB-6G引起細(xì)胞凋亡均明顯減少,說明了激活的PERK及CHOP對于IMB-6G發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的重要作用。在IRE1α途徑中,我們首先檢測到IMB-6G可以激活I(lǐng)RE1α。由于TRAF6-ASK1-JNK復(fù)合體的形成是IRE1α途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要原因,WB結(jié)果也檢測到IMB-6G對ASK1和JNK的激活作用。采用siRNA和抑制劑分別抑制ASK1和JNK的活性,均能部分減弱IMB-6G的促細(xì)胞凋亡作用。同時(shí),XBP1作為IRE1α途徑激活的特異剪接體,通過熒光顯微鏡觀察到IMB-6G作用之后XBP1被切割激活。另外,我們未檢測到IMB-6G對具有細(xì)胞保護(hù)作用的ATF6途徑的影響�？傊�,我們的研究表明,槐定酸類衍生物IMB-6G通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK和IRE1α兩條途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,并且它們分別介導(dǎo)的PERK-CHOP、IRE1α-ASK1-JNK兩條信號通路的激活在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。自噬是細(xì)胞的一種自我消化過程,將胞漿內(nèi)容物包裹在雙層膜結(jié)構(gòu)中,然后運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中進(jìn)行降解和再循環(huán)。自噬是腫瘤細(xì)胞抵抗應(yīng)激的一種自我保護(hù)和生存機(jī)制,能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和藥物抵抗,抑制其活性可能產(chǎn)生抗腫瘤活性。研究中發(fā)現(xiàn),槐定酸類衍生物6b顯示出良好的抗腫瘤活性,但6b是否通過自噬途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性還不明確。因此,本部分我們對6b的抗腫瘤作用與腫瘤細(xì)胞自噬的關(guān)系進(jìn)行了研究。首先,通過GFP-LC3的聚集實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)6b能夠引起LC3的點(diǎn)狀聚集,同時(shí)通過WB實(shí)驗(yàn),檢測到LC3-Ⅱ蛋白水平也明顯升高,但不能以此判斷6b是否增強(qiáng)了細(xì)胞自噬水平。作為細(xì)胞中自噬活性的金標(biāo)準(zhǔn),p62參與到細(xì)胞自噬的全過程,最終在溶酶體中被降解。實(shí)驗(yàn)中我們檢測到化合物6b可以濃度依賴性和時(shí)間依賴性地升高p62的蛋白水平,初步說明6b抑制了細(xì)胞中的自噬活性。隨后采用LC3 Turnover的實(shí)驗(yàn)方法,加入自噬抑制劑CQ和自噬增強(qiáng)劑Rapamycin。在合用CQ之后,沒有檢測到細(xì)胞中LC3-Ⅱ的進(jìn)一步明顯升高,說明LC3-Ⅱ被自噬溶酶體途徑降解的很少。而合用Rapamycin后LC3-Ⅱ水平比單獨(dú)的6b組有所升高,印證了化合物6b可能抑制了細(xì)胞中自噬體的降解。再者,我們采用mCherry-EGFP-LC3的雙熒光表達(dá)質(zhì)粒,利用GFP熒光在溶酶體酸性環(huán)境下不穩(wěn)定易淬滅的特點(diǎn),通過mCherry紅色熒光和GFP綠色熒光表達(dá)的差異,判斷自噬活性的變化。激光共聚焦的結(jié)果表明,6b作用之后,細(xì)胞中的紅色熒光和綠色熒光點(diǎn)狀聚集均出現(xiàn)增加,并且變化基本同步,說明細(xì)胞中的自噬體水平增加,但自噬溶酶體水平并沒有增加。后期的實(shí)驗(yàn)中,我們采用溶酶體染料LysoTracker檢測溶酶體的活性,在6b作用之后LysoTracker紅色明顯減弱,說明6b可能抑制了溶酶體的酸性,減弱了溶酶體的降解能力。與我們前期觀察到的LC3-Ⅱ蛋白水平升高、p62蛋白水平升高的結(jié)果相吻合,同時(shí)熒光顯微鏡的結(jié)果也推測6b可能使溶酶體的活性受到抑制。以上研究結(jié)果表明,化合物6b可能通過抑制溶酶體的酸性,破壞了溶酶體的降解功能,影響了自噬作為細(xì)胞中小分子循環(huán)和能量供應(yīng)的作用,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我國屬于肝癌高發(fā)地區(qū),新發(fā)肝癌病例占全球的55%左右,且死亡人數(shù)占全球的51%。深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制有助于肝癌的及早發(fā)現(xiàn)與治療。GSK-3β作為一種Ser/Thr激酶,參與到細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、凋亡等眾多生物過程中。同時(shí)多項(xiàng)研究表明,在多種腫瘤細(xì)胞中GSK-3β均表現(xiàn)出異常表達(dá),但GSK-3β如何促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展還不清楚。我們的目標(biāo)是闡明其在肝癌細(xì)胞中的作用。ASK1作為MAP3K家族的一個(gè)成員,屬于細(xì)胞中的促凋亡因子之一,在ROS等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)中,使用H202作為刺激因子,選用人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721作為研究對象,首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到GSK-3β siRNA可以明顯增強(qiáng)H202誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同時(shí),過表達(dá)GSK-3β可以顯著減少H202引起的細(xì)胞死亡,初步證明了GSK-3β對肝癌細(xì)胞的保護(hù)作用。在真核生物中,Thr845位點(diǎn)的磷酸化對于ASK1的活性具有重要意義,我們在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)野生型HA-GSK-3β WT和突變失活型 HA-GSK-3β K85A 質(zhì)粒,WB 檢測到 HA-GSK-3β WT 降低了 H202 誘導(dǎo)的 p-ASK1(Thr845)的蛋白水平,而失活的 HA-GSK-3β K85A 使 H202 誘導(dǎo)的 p-ASK1(Thr845)的蛋白水平升高。同樣地,在HepG2細(xì)胞中沉默GSK-3β的表達(dá)后,也檢測到p-ASK1(Thr845)的水平增加,再次證明了 GSK-3β對ASK1磷酸化的抑制作用。為了說明GSK-3β使ASK1磷酸化水平降低的原因,我們首先檢測了 ASK1蛋白本底水平的變化,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GSK-3β可以降低ASK1蛋白的表達(dá)水平。隨后,加入蛋白酶體抑制劑MG132和轉(zhuǎn)錄后抑制劑CHX,結(jié)果表明,當(dāng)加入MG132之后,GSK-3β降低ASK1的作用受到了抑制。加入CHX后,過表達(dá)GSK-3β可以明顯加速ASK1的降解速度。這些結(jié)果說明GSK-3β對ASK1的調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,并且ASK1的降解依賴蛋白酶體途徑。而后,通過Ubiquitination實(shí)驗(yàn),我們檢測到HA-GSK-3βWT可以使ASK1的泛素化水平增加,而HA-GSK-3β K85A不影響ASK1的泛素化水平,這提示我們GSK-3β可能是通過調(diào)節(jié)ASK1的泛素化修飾,影響其降解過程。文獻(xiàn)表明,Roquin-2和CHIP E3泛素連接酶和去泛素化酶USP9X可能參與ASK1的泛素化過程,我們通過siRNA和抑制劑的結(jié)合使用,證明了 GSK-3β通過USP9X影響ASK1的泛素化,而不依賴于E3連接酶Roquin-2和CHIP�？傊�,研究結(jié)果說明,在肝癌細(xì)胞中GSK-3β通過抑制去泛素化酶USP9X的作用,促進(jìn)ASK1的泛素化途徑降解,使ASK1的蛋白表達(dá)水平降低,從而發(fā)揮其促進(jìn)肝癌細(xì)胞存活的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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