發(fā)布時(shí)間：2018-01-10 03:17

  本文關(guān)鍵詞：小腦、腦干在大鼠喉化學(xué)反射和小鼠眨眼條件反射中的調(diào)控機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 喉化學(xué)反射 延髓 小腦 c-fos 腹部呼吸肌群 孤束核 喉化學(xué)反射 兒茶酚胺能 5-羥色胺能 膽堿能 fos樣免疫陽(yáng)性 背外側(cè)孤束核 疑核 中縫隱核 小腦 頂核 眨眼條件反射 DREADD 光遺傳學(xué) 小腦 間位核 頂核 眨眼條件反射 體

【摘要】：第一章參與大鼠喉化學(xué)反射的神經(jīng)元在小腦、腦干中的解剖學(xué)分布研究目的:喉化學(xué)反射效應(yīng)包括聲門關(guān)閉、呼吸暫停、血壓升高等,是新生兒猝死綜合征的主要誘因之一。胃食管返流導(dǎo)致食物或消化液等異物逆流進(jìn)入喉腔刺激引起喉化學(xué)反射,研究證明該癥狀與新生兒腦干發(fā)育不全相關(guān)。喉化學(xué)反射是簡(jiǎn)單反射,其反射中樞主要位于延髓,但參與其調(diào)控的神經(jīng)核團(tuán)并不清楚。小腦頂核參與包括呼吸調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種生理機(jī)能反射,其是否參與喉化學(xué)反射尚未見報(bào)道。該部分研究旨在找到參與大鼠喉化學(xué)反射的延髓、小腦神經(jīng)核團(tuán)。方法:成年雄性SD大鼠實(shí)驗(yàn)組在麻醉狀態(tài)下經(jīng)KCl-HCl灌注喉腔誘導(dǎo)喉化學(xué)反射,同時(shí)記錄腹部呼吸肌群灌注前后肌張力變化。對(duì)照組行與實(shí)驗(yàn)組相同操作但不予化學(xué)灌注。隨后采用c-fos免疫熒光標(biāo)記小腦、腦干中被激活神經(jīng)的分布,并在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分析,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的分布、數(shù)量差異。結(jié)果:化學(xué)刺激誘導(dǎo)大鼠喉化學(xué)反射,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部呼吸肌群張力顯著降低,呼吸節(jié)律明顯下降并出現(xiàn)呼吸暫�，F(xiàn)象。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,延髓雙側(cè)孤束核、前庭復(fù)合核、疑核疏松結(jié)構(gòu)、頭端腹側(cè)呼吸組、腹外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、前包欽格復(fù)合核、包欽格復(fù)合核、三叉神經(jīng)脊核和中縫隱核的Fos樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元經(jīng)喉化學(xué)反射激活,數(shù)量明顯增加。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小腦中未發(fā)現(xiàn)Fos樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元。結(jié)論:延髓是喉化學(xué)反射調(diào)控中樞,多個(gè)神經(jīng)核參與大鼠喉化學(xué)反射調(diào)控;小腦可能不參與喉化學(xué)反射。第二章延髓兒茶酚胺能,5-羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元參與大鼠喉化學(xué)反射調(diào)控目的:兒茶酚胺能,5-羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元在延髓廣泛分布。我們過去的研究顯示喉運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元接受兒茶酚胺能和5-羥色胺能神經(jīng)元投射,而所有喉運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元本身均表現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元特性。病理學(xué)研究強(qiáng)調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)兒茶酚胺能和5-羥色胺能通路異常是新生兒猝死綜合征的主要誘因。因此我們有理由推測(cè)延髓兒茶酚胺能、5-羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元參與調(diào)控喉化學(xué)反射,該部分研究目的是發(fā)現(xiàn)這三種遞質(zhì)能神經(jīng)元經(jīng)喉化學(xué)反射誘導(dǎo)激活后在延髓的分布情況。方法:本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組成年SD大鼠采用KCl-HCl喉腔灌流誘導(dǎo)麻醉狀態(tài)下喉化學(xué)反射。對(duì)照組行同樣操作但不誘導(dǎo)喉化學(xué)反射。通過延髓切片免疫組織化學(xué)分析,fos樣免疫陽(yáng)性分別與酪氨酸羥化酶免疫陽(yáng)性、5-羥色胺免疫陽(yáng)性以及膽堿囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體免疫陽(yáng)性共同標(biāo)記,分別指征經(jīng)喉化學(xué)反射誘導(dǎo)激活的兒茶酚胺能、5-羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元。隨后在熒光顯微鏡下觀察經(jīng)喉化學(xué)反射激活的三種遞質(zhì)能神經(jīng)元在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中的分布情況。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組中,疑核疏松結(jié)構(gòu)中觀察到c-fos-膽堿囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體免疫陽(yáng)性雙標(biāo)神經(jīng)元;延髓背外側(cè)孤束核中12.71%的fos樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元同時(shí)顯示酪氨酸羥化酶免疫陽(yáng)性(兒茶酚胺能),中縫隱核中70.87%的FLI神經(jīng)元為5-羥色胺能神經(jīng)元。對(duì)照組延髓切片中并無找到上述免疫陽(yáng)性雙標(biāo)神經(jīng)元。結(jié)論:大鼠延髓疑核疏松結(jié)構(gòu)內(nèi)膽堿能喉運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、背外側(cè)孤束核中部分兒茶酚胺能神經(jīng)元和中縫隱核大部分5-羥色胺能神經(jīng)元均參與調(diào)控喉化學(xué)反射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示該部分神經(jīng)元功能失調(diào)可能是引起新生兒猝死綜合征的原因。第三章小腦頂核調(diào)控小鼠眨眼條件反射的行為學(xué)研究目的:眨眼條件反射是常用于研究聯(lián)想性學(xué)習(xí)神經(jīng)機(jī)制的巴浦洛夫條件反射之一。來自腦橋的苔狀纖維和延髓下橄欖核的攀緣纖維分別將條件刺激和非條件刺激傳入小腦皮層和小腦深部核團(tuán),經(jīng)小腦整合并傳出信息,引發(fā)眨眼條件反射和非條件反射。以往研究表明小腦深部核團(tuán)是參與眨眼條件反射的重要單元,長(zhǎng)期損毀未訓(xùn)小鼠小腦深部核團(tuán)導(dǎo)致其學(xué)習(xí)障礙,或致使訓(xùn)后小鼠眨眼條件反射消失。尚無報(bào)道顯示短期或在條件刺激期間暫時(shí)阻斷頂核對(duì)小鼠眨眼條件反射影響如何。頂核是小腦進(jìn)化過程中最先出現(xiàn)的深部核團(tuán),參與多種生理功能及反射,其在眨眼條件反射中的作用至今未知。該部分研究目的是:1.探究頂核是否參與小鼠眨眼條件反射;2.研究在學(xué)習(xí)期間阻斷頂核,對(duì)未訓(xùn)小鼠學(xué)習(xí)過程的影響;3.觀察短期或條件刺激期間暫時(shí)阻斷頂核,訓(xùn)后小鼠眨眼條件反射的行為學(xué)變化。方法:1.觀察、記錄并比較此采用蠅蕈醇至成年C57BL/6訓(xùn)后小鼠頂核微量注射前,注射后5min和注射后一天的眨眼條件反射行為學(xué)變化。2.采用designed receptor exclusively activated by designed drugs(DREADD)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)短時(shí)間阻斷頂核或間位核。第1-10天給予成年C57BL/6未訓(xùn)小鼠每天學(xué)習(xí)前腹腔注射氯氮平-N-氧化物激活DREADD系統(tǒng),隨后進(jìn)行眨眼條件反射學(xué)習(xí)訓(xùn)練;第11-17天終斷氯氮平-N-氧化物給藥,訓(xùn)練至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物形成良好條件反射;第18-19天恢復(fù)氯氮平-N-氧化物注射,觀察小鼠眨眼條件反射行為學(xué)變化。3.采用光遺傳學(xué)技術(shù)激活成年訓(xùn)后L7cre/Ai27小鼠浦肯野細(xì)胞軸突末梢,從而抑制頂核神經(jīng)元活動(dòng)。觀察在條件刺激全段(0-250 ms)、前半段(0-125 ms)和后半段(125-250 ms)抑制頂核時(shí)小鼠眨眼條件反射行為學(xué)變化。結(jié)果:1.與微量注射蠅蕈醇前相比,注射至頂核5min后條件反射消失;注射后一天條件反射試驗(yàn)數(shù)量占總試驗(yàn)百分比、條件閉眼幅度與注射前相比無顯著差異。2.與對(duì)照組相比,頂核、間位核DREADD組同樣可以習(xí)得并表達(dá)條件反射,但所表達(dá)的條件反射幅度顯著低于對(duì)照組。3.光遺傳學(xué)手段于條件刺激0-125 ms,125-250 ms,0-250 ms抑制頂核均可顯著降低條件閉眼幅度,但條件反射試驗(yàn)數(shù)量占總試驗(yàn)百分比與非光遺傳刺激條件反射相比無顯著差異。結(jié)論:小腦頂核參與小鼠眨眼條件反射,阻斷其可導(dǎo)致未訓(xùn)小鼠建立條件反射延遲,但是否影響訓(xùn)后小鼠條件反射還有待研究。第四章小鼠眨眼條件反射過程中間位核、頂核神經(jīng)元體內(nèi)電生理學(xué)研究目的:電生理學(xué)研究結(jié)合巴浦洛夫反射揭示了小腦運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)的神經(jīng)機(jī)制。眨眼條件反射過程中小腦皮層神經(jīng)元電生理活動(dòng)已被前人闡述。作為小腦傳出神經(jīng)元所在的唯一區(qū)域,小腦深部核團(tuán)在眨眼條件反射中扮演信息整合、轉(zhuǎn)換和傳出的重要作用,但其電生理學(xué)放電模式至今未見報(bào)道。頂核內(nèi)包含多種類型神經(jīng)元,伽馬氨基丁酸能神經(jīng)元在眨眼條件反射中的電生理調(diào)控模式有待研究。小腦間位核、頂核調(diào)控眨眼條件反射的傳出神經(jīng)通路不同,二者是否有共同腦干傳入通路還不清楚。該部分研究的目的是:1.研究小腦間位核、頂核神經(jīng)元在小鼠眨眼條件反射過程中的放電模式;2.光遺傳學(xué)技術(shù)標(biāo)記頂核伽馬氨基丁酸能神經(jīng)元,并探究該類神經(jīng)元在眨眼條件反射中的電生理學(xué)特征;3.利用逆向神經(jīng)示蹤技術(shù)研究在眨眼條件反射中頂核、間位核的共同傳入神經(jīng)元。方法:所有小鼠經(jīng)眨眼條件反射方案訓(xùn)練至形成穩(wěn)定、良好的條件反射。1.形采用細(xì)胞外電生理技術(shù)記錄小腦頂核、間位核在成年C57BL/6小鼠眨眼條件反射過程中的放電過程,并用攝像機(jī)記錄小鼠眼瞼對(duì)條件刺激和非條件刺激的反應(yīng)。在電生理記錄最后一天記錄結(jié)束后,采用玻璃電極微量注射霍亂毒素B亞單位以標(biāo)記記錄區(qū)域。2.于成年Gad2-cre小鼠頂核微量注射hSyn1-AAV-flex-chrimson-tdtomato并在同一鉆孔處植入長(zhǎng)2 mm光纖。病毒三周充分表達(dá)后,細(xì)胞外電生理記錄對(duì)在體光刺激有反應(yīng)的頂核神經(jīng)元,隨后測(cè)試該類神經(jīng)元在眨眼條件反射試驗(yàn)中的放電模式。結(jié)果:1.采用體內(nèi)電生理總共記錄42個(gè)頂核神經(jīng)元,其中25個(gè)(60%)神經(jīng)元在條件反射期間表現(xiàn)神經(jīng)沖動(dòng)易化,其余表現(xiàn)沖動(dòng)抑制;6個(gè)(14%)頂核神經(jīng)元放電頻率與條件反射性眼瞼閉合幅度相關(guān)�？偣灿涗�270個(gè)間位核神經(jīng)元,其中部分(30%)神經(jīng)元表現(xiàn)沖動(dòng)易化;20個(gè)(7.4%)間位核神經(jīng)元放電頻率與條件反射性眼瞼閉合幅度相關(guān)。2.總共在Gad2-cre小鼠頂核記錄到31個(gè)對(duì)在體光刺激有反應(yīng)的細(xì)胞,其中10個(gè)細(xì)胞在體內(nèi)光刺激區(qū)間放電頻率增高(伽馬氨基丁酸能神經(jīng)元),該類細(xì)胞對(duì)條件刺激無調(diào)制效應(yīng);其余21個(gè)細(xì)胞在體內(nèi)光刺激區(qū)間放電頻率降低(受局部抑的制神經(jīng)元),該類細(xì)胞對(duì)條件刺激的調(diào)制效應(yīng)均為沖動(dòng)易化。結(jié)論:1.小腦頂核、間位核神經(jīng)元在條件眨眼反射過程中表現(xiàn)多種調(diào)制效應(yīng),調(diào)控反射的開始、進(jìn)行和結(jié)束;部分神經(jīng)元放電頻率與眼瞼閉合幅度相關(guān),暗示該部分神經(jīng)元在眨眼條件反射中調(diào)節(jié)眼瞼運(yùn)動(dòng),可能是運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)記憶的重要參與部分。2.頂核伽馬氨基丁酸能神經(jīng)元可能不參與條件眨眼反射;頂核內(nèi)受局部抑制的神經(jīng)元參與調(diào)控眨眼條件反射。
[Abstract]:In the experimental group , the expression of catecholamines , 5 - hydroxytryptamines and cholinergic neurons in the brain stem of adult male Sprague - Dawley rats were studied . 鑳嗙⒈鑳界�灳l忓厓.闅忓悗鍦ㄨ崸鍏夋樉寰�闀滀笅瑙傚療缁忓枆鍖栧�﹀弽灝勬縺媧葷殑涓夌�嶉�掕川鑳界�灳l忓厓鍦ㄥ疄楠岀粍,瀵圭収緇勪腑鐨勫垎甯冩儏鍐，

本文編號(hào)：1403633