發(fā)布時間：2018-01-11 01:13

  本文關(guān)鍵詞：不同方法純化顆粒脂肪的效果評價及其對移植后轉(zhuǎn)歸的影響　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：自體脂肪移植術(shù)(autologus fat transplantation,AFT),又稱自體脂肪注射,是利用自身脂肪組織作為填充材料修復皮下軟組織缺損一種手段。與人造材料和異種材料相比,自體脂肪獲取便捷,價格低廉且具有更好生物相容性,在整形美容外科中的應用非常廣泛。臨床工作中,移植后脂肪的存活情況是醫(yī)患雙方最為關(guān)注的問題,而抽吸后脂肪的純化處理與脂肪組織的存活情況直接相關(guān)。目的對棉墊吸附(AWG,Absorptionwithgauze)法、離心分離(CEN,Centrifugation)法以及靜置沉淀(DEC,Decantation)法純化處理脂肪的效果進行評價,并在動物實驗中對移植物轉(zhuǎn)歸進行比較分析,以初步探索其影響移植物存留和轉(zhuǎn)歸的具體機制。方法將人腹部來源的抽吸顆粒脂肪分別經(jīng)棉墊吸附法、離心分離法、靜止沉淀法進行純化處理。在體外實驗中,將純化后脂肪經(jīng)高速離心處理,使得液體成分、油脂、脂肪組織分離,測量各自體積以評價不同方法的純化效力。通過組織學檢測和代謝功能檢測對不同方法純化后脂肪組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性進行比較;經(jīng)膠原酶消化獲得脂肪組織中的血管周圍基質(zhì)成分(Stromal Vascular Fraction,SVFs),利用流式細胞分析儀對中的細胞成分進行分析;將SVFs細胞貼壁培養(yǎng)至第三代,獲得脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs,)利用 CCK8(Cell Counting Kit-8)試劑繪制細胞增殖曲線,并對其細胞周期和凋亡情況進行檢測,通過成脂、成骨、成軟骨分化對其分化活性進行比較;使用免疫缺陷小鼠構(gòu)建顆粒脂肪移植的動物模型,于注射后3天,6天,9天,12天,3周,6周,9周,12周取出移植后脂肪。通過稱取移植物重量、測量體積對不同方法純化后脂肪組織的存留情況進行比較;組織學用脂周蛋白染色標記活性良好的脂肪細胞,比較不同方法純化后脂肪在體內(nèi)的存活情況。利用液相芯片、Western blot、實時熒光定量PCR,從血管再生、炎性物質(zhì)表達、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達與膠原重構(gòu)等幾個方面觀察脂肪移植物的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸,進而探索不同的顆粒脂肪純化方法對脂肪移植物存留的影響。結(jié)果不同方法純化后脂肪中含水量由高到低依次為:靜止沉淀組、離心分離組、棉墊吸附組;與之相反,脂肪組織的含量由高到低依次為:棉墊吸附組、靜置沉淀組、離心分離組;而離心組純化脂肪高速離心后,分離出的油脂高于靜止組和棉墊組。不同方法純化后脂肪組織在結(jié)構(gòu)完整性、葡萄糖代謝能力等方面均無顯著差異。不同方法純化后脂肪組織中SVFs及ADSCs的含量由高到低依次為:棉墊組、離心組、靜止組。而紅細胞的含量由高到低依次為:靜止組、離心組、棉墊組。三種純化方法對ADSCs的增殖活性、細胞周期和凋亡情況的影響基本一致。三種方法對ADSCs分化活性的影響無明顯差異。移植后脂肪體積隨著時間延長呈現(xiàn)下降趨勢,但隨著時間延長下降幅度逐漸減小。在移植后各個時間點,移植物體積比較:棉墊組離心組靜止組,差異有統(tǒng)計學意義。在移植后各個時間點,移植物重量比較:棉墊組離心組靜止組。且下降幅度大于體積。組織學檢測可以發(fā)現(xiàn),脂肪移植后脂肪組織的轉(zhuǎn)歸趨勢為:脂肪細胞退變(去分化和崩解壞死)并伴隨炎性物質(zhì)表達增加→形成囊腔結(jié)構(gòu)→膠原沉積→血運重建→脂肪再生的基本趨勢。離心分離法純化后脂肪組織中在脂肪細胞退變過程中,更多發(fā)生脂肪細胞的崩解壞死,少見去分化的脂肪細胞。利用蛋白液相芯片技術(shù)對移植后早期脂肪組織中細胞的早期凋亡情況進行檢測,對于移植物中多種炎性因子的檢測可以發(fā)現(xiàn),多數(shù)炎性因子呈現(xiàn)低表達,IL-6,IL-1,GM-CSF,IFN-g在脂肪移植后早期顯著增高后回落;IL-10、IL-12、IL13在脂肪組織中表達量極低,其表達不受是否植入體內(nèi)和時間變化的影響。IL-2、IL-4、IL-5、IFN-G、TNF-α雖然在組織中有一定表達,但并未受到不同干預因素和移植處理的影響。離心分離組移植后早期炎性物質(zhì)IL-6,IL-1表達更高,與靜置沉淀法和棉墊吸附法純化后脂肪組織間差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.抽吸后脂肪組織的濃縮純化效果與移植后脂肪的組織存留量直接相關(guān):純化濃縮效果越好,移植后脂肪組織的存留率越高。三種純化方法相比較,棉墊吸附法純化效果最好,離心分離法次之,靜置沉淀法濃縮純化效率最低。2.離心分離法(1200g離心力,3min)在純化過程中對脂肪細胞造成了臨界的機械損傷,在體外的功能檢測中不易發(fā)現(xiàn),但在移植后的失養(yǎng)環(huán)境中,脂肪細胞出現(xiàn)更多的崩解壞死。3.在免疫缺陷裸小鼠構(gòu)建的脂肪移植模型中,脂肪組織的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸可以劃分為三個階段(1)快速損耗與炎癥啟動期(D1-D7)—移植物中液體成分的快速吸收,移植物存留量減少,同時炎性物質(zhì)表達逐漸增加;(2)脂肪退變與血運重建期(W1-W3)—脂肪細胞發(fā)生崩解壞死和去分化,炎性物質(zhì)迅速到達峰值后回落,新生血管逐漸形成(3)基質(zhì)重構(gòu)與脂肪再生期(W3-)---前期大量膠原沉積,后期逐漸降解,新生脂肪細胞出現(xiàn)并逐漸增多。4.良好的濃縮效果,使得棉墊吸附組和離心分離組移植物中的ASCs富集,移植后脂肪中VEGFR表達高,膠原重構(gòu)發(fā)生早,有益于脂肪細胞的再生。5.由于脂肪細胞活性受損,離心分離法純化后脂肪組織移植后IL-1,IL-6等炎性物質(zhì)表達增高。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R622.9

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