發(fā)布時(shí)間：2018-01-14 01:18

  本文關(guān)鍵詞：PM2.5加劇慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能障礙及對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的影響　出處：《蘭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：PM2.5加劇慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能障礙機(jī)制研究及黨參多糖的保護(hù)作用背景與目的:大氣污染物主要成分細(xì)顆粒物(空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑小于等于2.5μm的顆粒物,簡稱PM2.5)的濃度增加可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率、就診人次增加,慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)患者在PM2.5升高時(shí)更加容易發(fā)生急性加重,但具體機(jī)制不清。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)吞噬功能降低可能與慢阻肺急性加重相關(guān),但PM2.5對(duì)慢阻肺AM吞噬功能影響研究較少。傳統(tǒng)中藥黨參因其免疫調(diào)節(jié)、抗炎、增強(qiáng)免疫力等作用被廣泛應(yīng)用于肺部疾病的預(yù)防和治療,但因中藥成分復(fù)雜,其具體作用機(jī)制不清,其主要成分黨參多糖(CPP)具有提高巨噬細(xì)胞吞噬功能、抗氧化抗炎作用,但在慢阻肺中的應(yīng)用鮮見報(bào)道。因此,本研究擬探討PM2.5對(duì)慢阻肺小鼠AM吞噬功能缺陷的影響,PM2.5造成的肺組織氧化應(yīng)激水平、肺組織和全身炎癥反應(yīng)水平,并探討CPP對(duì)PM2.5加劇慢阻肺小鼠AM吞噬功能、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法:50只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組、慢阻肺組、慢阻肺PM2.5組、慢阻肺CPP組、慢阻肺CPP+PM2.5組,每組10只。采用單純香煙煙霧暴露連續(xù)90d建立慢阻肺小鼠模型,所有PM2.5干預(yù)組給予PM2.5(770μg/m3)霧化吸入連續(xù)90d,所有CPP干預(yù)組給予CPP(300mg/kg)灌胃連續(xù)90d。造模結(jié)束后采用小鼠無創(chuàng)體描箱檢測(cè)肺功能,吸氣峰流速(PIF)和呼氣峰流速(PEF);頸椎脫臼法處死小鼠,經(jīng)氣管生理鹽水全肺灌洗獲得支氣管肺泡灌洗液(BALF),無菌獲取肺組織,檢查其病理形態(tài)學(xué)改變,計(jì)算肺平均內(nèi)襯間隔(MLI);采用不連續(xù)密度梯度離心法分離AM,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AM吞噬熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的大腸桿菌(FITC-E.coli)的能力,用平均熒光強(qiáng)度(MFI)、吞噬E.coli陽性細(xì)胞百分比(吞噬%)表示。分別用菲羅啉比色法、硫代巴比妥酸比色法、改良Hafeman法檢測(cè)肺組織勻漿總抗氧化物能力(TAC)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)BALF和血清中白介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。結(jié)果:1.小鼠肺功能:慢阻肺組PIF和PEF:(7.63±0.94)、(4.43±0.63)顯著低于健康對(duì)照組組(11.85±1.28)、(7.38±0.82),慢阻肺PM2.5組PIF和PEF:(5.62±0.53)、(3.11±0.41)顯著低于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺CPP組PIF和PEF:(8.79±0.51)、(5.98±0.34)和慢阻肺CPP+PM2.5組PIF和PEF(6.45±0.45)、(3.64±0.39)分別顯著高于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(均P0.01)。2.病理學(xué)改變:慢阻肺組肺組織有炎癥細(xì)胞浸潤和肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁破壞等肺氣腫改變,MLI比健康對(duì)照組顯著擴(kuò)大(55.51±2.17比32.92±1.30)(P0.01),慢阻肺PM2.5組上述改變較慢阻肺組嚴(yán)重,MLI(61.69±1.84)進(jìn)一步擴(kuò)大(P0.01),慢阻肺CPP組和慢阻肺CPP+PM2.5組則分別較慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組減輕,MLI(43.25±1.50、57.78±1.69)也較各自對(duì)照組縮小(P0.01)。3.AM吞噬功能:慢阻肺組MFI、吞噬%:(4939±924)、(30.90±5.19)%顯著低于健康對(duì)照組(10222±1567)、(69.11±5.59)%(均P0.01),慢阻肺PM2.5組MFI、吞噬%:(3293±543)、(20.91±3.51)%顯著低于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺CPP組MFI、吞噬%:(5903±484)、(38.53±2.84)%和慢阻肺CPP+PM2.5組MFI、吞噬%:(4064±418)、(26.88±1.84)%分別顯著高于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(均P0.01)。4.氧化應(yīng)激水平:慢阻肺組TAC和GSH-PX:(6.83±0.36)、(46.49±2.59)顯著低于健康對(duì)照組(17.99±0.09)、(84.32±5.65)(均P0.01),慢阻肺PM2.5組TAC和GSH-PX:(3.61±0.29)、(32.37±3.78)顯著低于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺CPP組TAC和GSH-PX:(8.80±0.26)、(53.40±4.02)和慢阻肺CPP+PM2.5組TAC和GSH-PX:(5.43±0.30)、(42.42±3.95)分別顯著高于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(均P0.01)。慢阻肺組MDA水平(2.73±0.22)顯著高于健康對(duì)照組(1.74±0.37)(P0.05),慢阻肺PM2.5組MDA水平(3.55±0.33)顯著高于慢阻肺組(P0.01),慢阻肺CPP組MDA水平(2.22±0.28)和慢阻肺CPP+PM2.5組MDA水平(2.72±0.44)分別顯著低于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.01)。5.BALF和血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平:慢阻肺組(1136.17±79.12、456.74±38.58)、(336.80±36.57、248.77±31.92)、(201.72±37.65、29.17±9.77)顯著高于健康對(duì)照組(350.42±71.94、224.23±32.84)、(50.25±7.79、62.65±11.90)、(44.58±20.35、0.60±0.35)(均P0.01),慢阻肺PM2.5組(1351.67±41.64、753.64±44.39)、(562.38±39.37、535.94±51.09)、(401.49±35.98、46.76±11.17)顯著高于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺CPP組(762.33±32.79、365.63±39.21)、(289.02±48.57、143.14±33.66)、(134.35±35.34、14.63±4.93)和慢阻肺CPP+PM2.5組(778.17±20.07、558.73±38.07)、(427.27±36.35、331.53±43.59)、(258.09±36.74、34.72±11.94)分別顯著低于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(均P0.01)。6.相關(guān)性分析:基礎(chǔ)狀態(tài)下、PM2.5干預(yù)、CPP干預(yù)及PM2.5聯(lián)合CPP干預(yù)后,慢阻肺小鼠MFI和吞噬%與TAC、GSH水平均呈正相關(guān),與MDA水平呈負(fù)相關(guān);慢阻肺小鼠MFI和吞噬%與BALF和血清中IL-6、IL-8、TNF-α均呈負(fù)相關(guān)(P0.05或P0.01)。結(jié)論:1.單純香煙煙霧暴露法可復(fù)制慢阻肺小鼠模型;2.慢阻肺小鼠AM吞噬大腸桿菌能力低下,肺組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài),肺組織局部和全身炎癥反應(yīng)增強(qiáng);3.PM2.5損害慢阻肺小鼠AM的吞噬能力,并加重氧化應(yīng)激、惡化肺組織局部及全身炎癥反應(yīng);4.CPP對(duì)慢阻肺小鼠和PM2.5干預(yù)后的慢阻肺小鼠AM均有保護(hù)作用,可改善其吞噬能力、氧化應(yīng)激狀態(tài)、肺局部及全身炎癥狀態(tài);5.CPP對(duì)AM吞噬能力的保護(hù)作用與其抗氧化、減輕炎癥作用密切相關(guān)。PM2.5對(duì)慢性阻塞性肺疾病小鼠Th17/Treg失衡及免疫炎癥反應(yīng)的影響背景與目的:T細(xì)胞亞群比例失衡及其導(dǎo)致的細(xì)胞炎癥因子分泌異常,從而引發(fā)異常的免疫炎癥反應(yīng)是慢阻肺重要的發(fā)病機(jī)制之一,Th17細(xì)胞過度增多而Treg細(xì)胞不能有效抑制可導(dǎo)致Th17細(xì)胞分泌過多的IL-17參與形成氣道慢性炎癥,而Treg分泌的IL-10減少則使得炎癥不能消散,參與慢阻肺的發(fā)病,但PM2.5對(duì)慢阻肺Th17、Treg細(xì)胞比例變化及IL-17、IL-10分泌的影響尚不清楚;Delta1、4-Notch1通路參與未分化T細(xì)胞向不同的亞群方向分化,但在慢阻肺中,AM上配體Delta1/4、T細(xì)胞上受體Notch1表達(dá)變化在Th17和Treg分化中的作用及PM2.5對(duì)該通路的影響研究較少;IL-6亦參與Th17細(xì)胞的分化調(diào)控,但在慢阻肺中IL-6是否參與調(diào)控及PM2.5對(duì)其的影響尚不清楚;AM可釋放IL-6等細(xì)胞因子,引發(fā)炎癥反應(yīng),但其是否可經(jīng)此途徑參與調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞失衡尚未見報(bào)道。因此本研究探討PM2.5對(duì)慢阻肺小鼠Th17、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg比值失衡及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-10產(chǎn)生的影響及與AM Delta1/4配體表達(dá)、脾臟T細(xì)胞Notch1受體表達(dá)、血清IL-6水平的關(guān)系。方法:50只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、慢阻肺組、慢阻肺PM2.5組、慢阻肺GSI(Notch信號(hào)通路特異性抑制劑γ分泌酶抑制劑)組、慢阻肺GSI+PM2.5組,每組10只。采用單純香煙煙霧暴露連續(xù)90d建立慢阻肺小鼠模型,所有PM2.5干預(yù)組給予PM2.5(770μg/m3)霧化吸入連續(xù)90d,所有GSI干預(yù)組自造模第61d至第90d隔日給予腹腔注射GSI(1mg/kg)。造模結(jié)束后采用小鼠無創(chuàng)體描箱檢測(cè)肺功能,PIF和PEF;頸椎脫臼法處死小鼠,無菌獲取肺組織,檢查其病理形態(tài)學(xué)改變,計(jì)算MLI;采用不連續(xù)密度梯度離心法分離AM,連續(xù)密度梯度離心法、尼龍毛柱法分離提純脾臟T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞占CD4陽性T細(xì)胞的百分比并計(jì)算Th17/Treg比值,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)AM上Delta1/4、T細(xì)胞Notch1的m RNA表達(dá),免疫印跡法檢測(cè)Delta1/4、Notch1蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、IL-17、IL-10水平。結(jié)果:1.肺功能及病理學(xué)改變:慢阻肺組PIF和PEF(7.63±1.12)、(4.44±0.70)顯著低于健康對(duì)照組(12.03±1.35)、(7.17±0.63)(P0.01)。慢阻肺組出現(xiàn)明顯的支氣管炎癥和肺氣腫改變,健康對(duì)照組未出現(xiàn)上述改變,慢阻肺組MLI(56.31±3.27)明顯比健康對(duì)照組(33.32±2.28)擴(kuò)大(P0.01),慢阻肺模型小鼠符合慢阻肺特征性改變。2.Th17亞群比例:慢阻肺組(17.69±5.08)顯著高于健康對(duì)照組(5.59±1.49),慢阻肺PM2.5組(32.16±6.06)顯著高于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺GSI組(12.11±1.83)和慢阻肺GSI+PM2.5組(27.57±7.38)分別顯著第于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.05或P0.01)。Treg亞群比例:慢阻肺組(0.84±0.29)顯著低于健康對(duì)照組(1.18±0.60),慢阻肺PM2.5組(0.45±0.16)顯著低于慢阻肺組(P0.05),慢阻肺GSI組(1.15±0.25)和慢阻肺GSI+PM2.5組(0.77±0.23)分別顯著高于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.05或P0.01)。Th17/Treg比值:慢阻肺組(22.50±7.72)顯著高于健康對(duì)照組(5.81±3.03),慢阻肺PM2.5組(77.32±22.14)顯著高于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺GSI組(11.07±3.13)和慢阻肺GSI+PM2.5組(38.72±15.04)分別顯著低于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.05或P0.01)。3.Delta1、Delta4、Notch1 m RNA和蛋白表達(dá):慢阻肺組(6.34±0.88、0.78±0.05)、(10.03±1.32、0.70±0.06)、(11.56±1.39、0.51±0.07)顯著高于健康對(duì)照組(1.20±0.72、0.54±0.48)、(1.06±0.38、0.51±0.07)、(1.03±0.28、0.29±0.05)(均P0.01),慢阻肺PM2.5組(9.97±3.38、1.05±0.07)、(19.08±3.40、0.88±0.05)、(23.11±5.98、0.77±0.06)顯著高于慢阻肺組(P0.05或P0.01),慢阻肺GSI組(2.23±0.56、0.69±0.05)、(7.27±1.27、0.63±0.05)、(7.74±1.01、0.41±0.05)和慢阻肺GSI+PM2.5組(4.00±3.54、0.90±0.10)、(12.66±2.07、0.77±0.06)、(17.05±2.40、0.63±0.06)分別顯著低于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.05或P0.01)。4.血清IL-6、IL-17、IL-10水平:慢阻肺組(492.64±61.05、60.70±2.57、2.60±0.47)顯著高于健康對(duì)照組(224.13±33.67、44.14±3.86、4.15±1.41)(均P0.01),慢阻肺PM2.5組(744.70±42.78、71.15±3.69、0.57±0.19)顯著高于慢阻肺組(均P0.01),慢阻肺GSI組(430.42±43.21、54.30±3.00、3.32±0.14)和慢阻肺GSI+PM2.5組(643.03±25.04、65.19±2.64、1.51±0.12)分別顯著低于慢阻肺組和慢阻肺PM2.5組(P0.05或P0.01)。5.相關(guān)性分析:基礎(chǔ)狀態(tài)下、PM2.5干預(yù)、GSI干預(yù)及PM2.5聯(lián)合GSI干預(yù)后慢阻肺小鼠:AM的Delta1、Delta4蛋白表達(dá)與血清IL-6水平呈正相關(guān),與T細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)呈正相關(guān);IL-6水平與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān);Notch1蛋白表達(dá)與Th17比例呈正相關(guān),與Treg比例呈負(fù)相關(guān),與Th17/Treg比值呈正相關(guān);Th17比例與血清IL-17水平呈正相關(guān),Th17/Treg比值與IL-17水平呈正相關(guān);Treg比例與血清IL-10水平呈正相關(guān),Th17/Treg比值與IL-10水平呈負(fù)相關(guān)(P0.05或P0.01)。結(jié)論:1.慢阻肺小鼠存在Th17細(xì)胞升高為主的Th17/Treg失衡,導(dǎo)致IL-17水平升高,IL-10水平降低,慢阻肺小鼠存在Th17/Treg細(xì)胞失衡導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),PM2.5可加重該免疫炎癥反應(yīng);2.慢阻肺小鼠AM上Delta1/4、T細(xì)胞上Notch1表達(dá)均上調(diào),PM2.5可使慢阻肺小鼠Delta1/4-Notch1的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào);3.PM2.5干預(yù)前后,慢阻肺小鼠Th17細(xì)胞升高為主的Th17/Treg失衡及IL-17水平升高的炎癥反應(yīng)狀態(tài)與Delta1/4、Notch1表達(dá)均上調(diào)有關(guān),GSI可部分逆轉(zhuǎn)PM2.5干預(yù)前后慢阻肺小鼠的免疫炎癥反應(yīng),與其抑制Delta1/4-Notch1通路活化相關(guān);4.慢阻肺小鼠血清IL-6含量增加,PM2.5加劇IL-6的過度釋放,參與調(diào)控Th17比例異常升高;AM Delta1/4表達(dá)上調(diào)與IL-6含量增加有關(guān),推測(cè)AM可能參與IL-6的異常釋放,導(dǎo)致Th17細(xì)胞異常升高,參與PM2.5干預(yù)前后慢阻肺的免疫炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1421396