發(fā)布時(shí)間：2018-05-06 22:04

  本文選題：miR-647 + 胃癌��； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：1背景與目的胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi),胃癌位居腫瘤死亡的第二位。中國是胃癌高發(fā)國家,全世界每年新發(fā)生的胃癌為75.5萬例,約35%發(fā)生在中國;胃癌的早期癥狀不明顯,確診胃癌時(shí)約有40%的患者已經(jīng)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前臨床上主要運(yùn)用放療,化療,手術(shù)等手段治療胃癌,但其總體死亡率并沒有得到明顯下降,進(jìn)展期胃癌腫瘤組織的快速生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是引起胃癌高死亡率的主要原因。與傳統(tǒng)治療相比,基因治療具有靶向精準(zhǔn),特異性強(qiáng),副作用小等優(yōu)點(diǎn),2004年1月我國研發(fā)的用于頭頸部治療腫瘤治療的重組p53腺病毒注射液,在全球率先上市。盡管大量的研究已經(jīng)報(bào)道了胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,但是其發(fā)病的病理生理學(xué)改變?nèi)圆幻鞔_。因此,進(jìn)一步探索胃癌發(fā)生發(fā)展的靶向治療因子是早期診斷和治療胃癌以及降低其死亡率的重要突破口。近年研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA、micro RNA)作為內(nèi)源性非編碼RNA具有靶向抑制其下游基因表達(dá)的生物學(xué)特性,與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物進(jìn)程相關(guān),調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病,有望成為腫瘤治療的靶向基因。由于micro RNA可靶向調(diào)控?cái)?shù)百個基因的表達(dá),其在惡性腫瘤的診斷和治療方面顯示出了非常好的應(yīng)用前景。近年研究發(fā)現(xiàn),miRNAs參與調(diào)節(jié)包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,同時(shí)Rawlings-Goss等發(fā)現(xiàn)miR-647與多種腫瘤相關(guān)并能作為胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)記物,但作用機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探討miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展的作用,本研究首先擬通過熒光定量PCR方法檢測人胃癌組織、人胃癌細(xì)胞株中miR-647表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與臨床病理特征(年齡、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和病理分型等)的相關(guān)性,以期明確miR-647表達(dá)在胃癌診斷和預(yù)后中的意義。進(jìn)一步構(gòu)建miR-647過表達(dá)慢病毒載體,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)觀察miR-647對胃癌細(xì)胞的作用,運(yùn)用基因芯片、生物學(xué)預(yù)測軟件、熒光定量PCR和Western Blot蛋白印記實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制,以期明確miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制。2方法2.1提取胃癌組織與胃癌細(xì)胞的總RNA(Trizol法),應(yīng)用熒光定量PCR比較胃癌組織與正常癌旁組織,胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜上皮細(xì)胞中miR-647的表達(dá)情況,進(jìn)一步分析miR-647表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征(年齡、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和病理分型等)的相關(guān)性;Transwell檢測人胃癌細(xì)胞株HGC-27、AGS、SGC-7901、MGC-803的侵襲能力。2.2構(gòu)建miR-647過表達(dá)的慢病毒載體,陽性重組克隆進(jìn)行序列驗(yàn)證;采用miR-647過表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803,其中空白組(Ctrl組)不做任何處理常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞,陰性組(NC組)轉(zhuǎn)染空病毒載體,實(shí)驗(yàn)組(647組)轉(zhuǎn)染miR-647過表達(dá)的慢病毒載體,嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803中miR-647的表達(dá);CCK-8法檢測miR-647過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞檢測miR-647過表達(dá)對胃癌細(xì)胞周期和凋亡的影響;電鏡下觀察miR-647對胃癌細(xì)胞的微觀形態(tài)改變;將成功轉(zhuǎn)染miR-647過表達(dá)慢病毒顆粒的人胃癌細(xì)胞株細(xì)胞懸液100ul(2x107個/ml)接種于5~6周裸鼠腋下(8只/組),每三天測量瘤體長短徑一次并計(jì)算腫瘤大小,21天后脫頸法處死裸鼠,HE法確認(rèn)腫瘤組織。2.3劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測miR-647對人胃癌細(xì)胞遷徙能力和侵襲能力的影響;將成功轉(zhuǎn)染miR-647過表達(dá)慢病毒顆粒的人胃癌細(xì)胞株細(xì)胞懸液100ul(8x105個/ml)注射入5~6周齡裸鼠尾靜脈(10只/組),36天后脫頸法處死裸鼠,HE染色檢測胃癌轉(zhuǎn)移模型的肝肺轉(zhuǎn)移情況。2.4采用人類全基因組表達(dá)芯片譜檢測miR-647過表達(dá)后人胃癌MGC-803的差異表達(dá)基因;生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-647的靶基因;熒光定量PCR和Western Blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測miR-647預(yù)測靶基因ANK2以及其下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白的表達(dá)情況。3.結(jié)果3.1熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對應(yīng)癌旁正常組織相比,在70例胃癌患者中43例患者胃癌組織中miR-647表達(dá)量下降,占61.43%;在70例胃癌病人中,與對應(yīng)癌旁正常組織相比,miR-647表達(dá)量明顯下調(diào)(P0.05);與胃黏膜正常細(xì)胞株GES-1相比,miR-647在人胃癌細(xì)胞株HGC-27,AGS,SGC-7901和MGC-803中表達(dá)下調(diào)(P0.05),Transwell結(jié)果顯示,與胃癌細(xì)胞株HGC-27和AGS相比,SGC-7901和MGC-803具有更強(qiáng)的侵襲能力且miR-647表達(dá)量與侵襲能力呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。臨床病理資料分析結(jié)果表明miR-647的表達(dá)量與胃癌組織的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。3.2陽性重組克隆測序結(jié)果顯示miR-647過表達(dá)載體序列正確;熒光定量PCR顯示,miR-647過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MGC-803后miR-647表達(dá)量上調(diào)(P0.05);CCK-8法提示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901和MGC-803的細(xì)胞增殖能力降低(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測顯示與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901和MGC-803的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(P0.05),凋亡率增加(P0.05);透射電鏡提示在647組SGC-7901和MGC-803中能觀察到細(xì)胞凋亡的典型特征;裸鼠瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901和MGC-803的裸鼠皮下移植瘤模型生長較慢(P0.05);HE染色顯示皮下移植瘤體為惡性腫瘤組織。3.3劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901和MGC-803細(xì)胞遷移能力下降(P0.05);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901和MGC-803細(xì)胞侵襲能力下降(P0.05);轉(zhuǎn)移瘤模型結(jié)果顯示,與NC組(50%)與Ctrl組(70%)相比,miR-647過表達(dá)的647組SGC-7901細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移率為10%,轉(zhuǎn)移率明顯降低(P0.05)。3.4全基因組檢測31741個基因,803-647與803-NC組相比,一共223個基因差異性表達(dá)(篩選條件為log2"#Flod change"#"g1.5,P�d0.05),其中上調(diào)基因數(shù)為113個,下調(diào)基因數(shù)為110個;miRanda,Target Scan和micro RNA三個生物學(xué)預(yù)測軟件顯示,至少兩個預(yù)測軟件預(yù)測的miR-647的靶基因交集有382個;芯片表達(dá)差異下調(diào)基因和生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶基因的交集為ANK2、ZNF609、KNDC1和TRIM4;熒光定量PCR顯示,ANK2與KNDC1在SGC-7901和MGC-803兩株細(xì)胞中均下調(diào)(P0.05);由于只有ANK2與腫瘤發(fā)生相關(guān),我們擬定ANK2為miR-647的下游靶基因的研究對象;同時(shí)Western Blot結(jié)果表明miR-647在SGC-7901和MGC-803兩株細(xì)胞細(xì)胞中抑制ANK2蛋白表達(dá)(P0.05);熒光定量PCR和Western Blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組與Ctrl組相比,miR-647過表達(dá)的647組中miR-647下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。4.結(jié)論4.1 miR-647在胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織,且與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān);miR-647在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)低于胃黏膜正常上皮細(xì)胞株且其表達(dá)量與細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。4.2成功構(gòu)建miR-647過表達(dá)慢病毒載體與miR-647過表達(dá)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803;miR-647過表達(dá)在體外能抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803的增殖,使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯,凋亡增加;同時(shí),在體內(nèi)能抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長。4.3 miR-647過表達(dá)能在體內(nèi)外抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803的轉(zhuǎn)移能力。4.4 ANK2可能為miR-647的直接靶基因,miR-647過表達(dá)可使人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803的ANK2和FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA與蛋白表達(dá)降低。創(chuàng)新點(diǎn)1.微小RNA與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物進(jìn)程密切相關(guān),調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病,本研究通過檢測miR-647在胃癌組織中的表達(dá),并進(jìn)一步分析其與臨床病理特征的關(guān)系,初步闡明了miR-647在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。2.本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建目的miR-647的慢病毒載體,從增殖和轉(zhuǎn)移兩個方面觀察其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并進(jìn)一步探討miR-647在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制,以期為胃癌的早期診斷和治療提供新的方向。
[Abstract]:In recent years , it has been found that microRNAs ( miRNA , micro RNA ) can be used as endogenous non - coding RNAs to treat gastric cancer . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was determined by fluorescence quantitative PCR , and the expression of miR - 647 in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by MTT assay . The expression of miR - 647 overexpression in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by immunohistochemistry . The expression of miR - 647 was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was lower than that of normal epithelial cells in gastric cancer .

【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 戴成雨;胃癌20例誤診分析[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2002年03期

2 李秋波,陶智慧,胡奎,韓智,馬勇;胃癌術(shù)前區(qū)域動脈灌注化療加手術(shù)聯(lián)合治療的療效觀察(附24例)[J];航空航天醫(yī)藥;2003年03期

3 倪海濱,毛振彪,黃介飛,肖明兵,季穎林,張彥亮,冒海蕾;血清可溶性細(xì)胞間粘附分子-1與胃癌臨床意義的研究[J];南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年01期

4 邢亞莉;姚春霞;唐曉君;劉春梅;;彩超在胃癌診斷中的價(jià)值[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2007年17期

5 ;日本專家用新技術(shù)提高胃癌診斷準(zhǔn)確率[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2009年02期

6 ;新技術(shù)能提高胃癌診斷準(zhǔn)確率[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年07期

7 高春光;;胃癌患者的臨床治療體會[J];中國民族民間醫(yī)藥;2009年14期

8 高瑞鳳;朱曄;劉興姣;;37例進(jìn)展期胃癌的超聲分析[J];中國實(shí)用醫(yī)藥;2010年25期

9 姜可偉;;規(guī)范全球第二大致死率疾病的診斷——《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》解讀[J];中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理;2010年04期

10 張常華;何裕隆;詹文華;吳英;;多學(xué)科小組與胃癌診治[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2011年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 武淑蘭;魏志杰;殷宇明;;胃癌致微血管病性溶血性貧血的診斷[A];第十一屆全國紅細(xì)胞疾病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

2 丁濤;;超聲在診斷胃癌中的應(yīng)用[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三屆全國肌肉骨骼超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2011年

3 陳曉康;呂國榮;蘇若瑟;;應(yīng)用彩色能量多普勒血流顯像對胃癌的診斷價(jià)值[A];慶祝中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會成立20周年——第八屆全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 于吉人;;胃癌的術(shù)前系統(tǒng)評估[A];2004年浙江省外科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2004年

5 楊軍樂;寧文德;董季平;徐敏;;多層螺旋CT在胃癌診斷中的應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三屆全國放射學(xué)大會論文匯編（下冊）[C];2006年

6 張曉鵬;;胃癌磁共振成像研究進(jìn)展[A];第四屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議教育集[C];2006年

7 張麗紅;常維平;黃賢會;;螺旋CT在特殊部位胃癌診斷中的應(yīng)用[A];中國醫(yī)師協(xié)會放射醫(yī)師分會首屆會員大會暨第四屆醫(yī)學(xué)影像山東論壇、山東省第16次放射學(xué)會議暨山東省第14屆醫(yī)學(xué)影像學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

8 陳靜;;彩色多普勒超聲檢查在胃癌的應(yīng)用[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第七屆全國腹部超聲學(xué)術(shù)會議學(xué)術(shù)論文匯編[C];2007年

9 劉池波;梁勇;王海寶;楊林軍;梁津逍;;胃癌患者中血清淀粉樣蛋白A的測定及臨床意義[A];第二屆中國醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會暨細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)改革會議論文集[C];2008年

10 吳厚賓;;腹腔鏡在胃癌診治中的應(yīng)用進(jìn)展(綜述)[A];江西省第二屆胃腸外科學(xué)術(shù)會議暨江西省第十二次中西醫(yī)結(jié)合普通外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 錢錚;新技術(shù)能提高胃癌診斷準(zhǔn)確率[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2009年

2 記者 陳青;胃癌患者從“存活”邁向“樂活”[N];文匯報(bào);2010年

3 李楠;胃癌診斷敏感性從不足30%提高到57.4%[N];健康報(bào);2008年

4 通訊員 李楠;胃癌“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”研究見成效[N];上海科技報(bào);2008年

5 記者 楚燕　通訊員 那偉 高樹灼;廈門胃癌研究達(dá)國際領(lǐng)先水平[N];廈門日報(bào);2009年

6 胡德榮;新型胃癌分子標(biāo)志物研究獲突破[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

7 本報(bào)記者 周芳;改善飲食習(xí)慣 早發(fā)現(xiàn)早治療[N];吉林日報(bào);2006年

8 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 楊燕貽;胃癌防治有哪些錯誤觀念[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

9 特約記者 程守勤;胃癌診斷又有新方法[N];家庭醫(yī)生報(bào);2003年

10 重慶萬州 黃瓊;胃癌的手術(shù)治療[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孫大志;基于microRNA 21的調(diào)控作用探討從痰論治胃癌的作用機(jī)制[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2012年

2 陳悅之;TNFAIP8在胃癌中的表達(dá)和對調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖，，影響侵襲及遷移中的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

3 殷繼鵬;腫瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 蔡習(xí)強(qiáng);TFEB介導(dǎo)的自噬在胃癌耐藥中的作用及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 趙曉迪;microRNA-7調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為的功能與分子機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 尚華;MicroRNA-125a在胃癌中表達(dá)水平的研究及其臨床意義[D];山東大學(xué);2015年

7 關(guān)中正;TGF-β在胃癌免疫逃逸中作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

8 黃勇;AEG-1/MT qDH、NF-κB、MMP-9在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性的研究[D];山東大學(xué);2015年

9 謝黎明;胃癌中miR-124表達(dá)的意義及作用機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2015年

10 劉佳寧;SOX9和CEACAM1在胃癌組織中表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響[D];山東大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐海蓉;胃癌危險(xiǎn)因素的流行病學(xué)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2002年

2 張軍利;p27、PTEN與VEGF蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

3 馬春婷;胃癌與幽門螺桿菌的相關(guān)性研究[D];石河子大學(xué);2015年

4 王士杰;腹腔鏡手術(shù)治療進(jìn)展期遠(yuǎn)端胃癌的臨床療效及患者術(shù)后隨訪生存質(zhì)量研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

5 李浩;胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選與鑒定[D];鄭州大學(xué);2015年

6 王巍;胃癌患者血液樣品的光譜分析[D];鄭州大學(xué);2015年

7 李玉博;高場磁共振在胃癌術(shù)前T分期與分級的價(jià)值[D];鄭州大學(xué);2015年

8 張?zhí)K鈺;SOX4和P53蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及貞芪扶正膠囊對胃癌術(shù)后輔助治療作用的觀察[D];蘭州大學(xué);2015年

9 馬來陽;能譜CT成像在胃癌術(shù)前分期及分化程度評價(jià)中的應(yīng)用研究[D];蘭州大學(xué);2015年

10 侯向紅;HORMAD2在胃癌中的表達(dá)及對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];蘭州大學(xué);2015年

本文編號：1854079