發(fā)布時間：2018-05-08 10:55

  本文選題：血管生長因子(VEGF) + 超聲微泡��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：喉鱗癌排在頭頸部惡性腫瘤第三位。喉癌外科治療歷史已有100多年,但對于晚期患者和復發(fā)后失去手術機會的患者,在常規(guī)手術治療或綜合治療均不能帶來明顯益處的時候,或者為了保全喉功能,而不愿意犧牲喉器官的時候,放化療就顯得尤為重要。但是目前臨床上所使用的很多抗癌藥物在治療過程中會引起患者惡心、嘔吐、骨髓抑制、免疫力下降、毛發(fā)脫落,胃腸道功能降低等眾多不良反應,患者在治療過程中往往無法承受這些副作用而中止治療。因此,如何減少這些抗癌藥物對人體的毒副作用,增加抗腫瘤藥物的療效成為當前迫切的任務和研究熱點。腫瘤靶向治療的研究應運而生,這種方法能夠根據腫瘤所表達的特殊抗體或配體選擇性地將抗藥物或基因運送到被識別出來的部位,并在一定外力條件或自身性質改變條件下將藥物或基因釋放出來,減少在全身循環(huán)中滯留的時間,從而減少全身不良反應,提高療效。隨著超聲造影劑的不斷深入研究,以攜帶特定配體為特點的靶向超聲造影技術使具有靶向作用的微泡能夠識別并結合靶點,通過血液聚集到我們希望觀察的組織或器官,并在靶組織或靶器官部位特異性顯影。超聲分子造影劑作為治療藥物載體的腫瘤靶向診斷與治療成為研究熱點,為喉鱗癌的治療提供了新的思路。腫瘤的生長依賴于腫瘤新生血管為它提供所需的一切營養(yǎng)物質。目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤血管生成相關的因子大約有30多種。其中血管內皮生長因子(VEGF)及其受體在腫瘤血管生成過程中起著非常重要的作用。隨著對喉鱗癌細胞及分子生物學機制研究的不斷深入,促血管生成因子的分子靶向治療為晚期喉鱗癌、喉鱗癌術后復發(fā)及轉移的患者提供了新的治療方式。紫杉醇是從紅豆杉屬植物紫杉的樹干、樹皮或針葉中提取開發(fā)得到的一種抗微管藥物。目前,PTX已被納入晚期頭頸部鱗癌器官保全性治療方案中。脂質微泡因其具有易分解、安全性好、對人體無害等優(yōu)點已被廣泛作為藥物或基因載體用于腫瘤治療等領域,靶向脂質微泡是在其表面連接有針對特異性抗原的抗體或針對特異性受體的配體,可以有選擇性地到達相應的組織或器官,并與之結合,使藥物或基因靶向地局部釋放,實現(xiàn)靶組織或靶器官的精確治療,減少全身循環(huán)中的滯留,從而減少全身毒副作用。本實驗中就是利用超聲微泡載紫杉醇,并使其具有主動靶向作用,有針對性的對細胞所表達的特異性受體作用,從而達到精確治療的目的。在本實驗中,我們利用靶向超聲分子探針制備技術和生物素-親和素方法將VEGF與載PTX藥物微泡連接,檢測VEGF靶向載PTX脂質微泡的抗體連接情況和理化性質,研究靶向載藥微泡與喉鱗癌細胞的靶向結合能力,并通過細胞學實驗和動物模型研究VTPLLM結合超聲靶向微泡破裂技術對喉鱗癌的作用及相關機制,從而為喉鱗癌的靶向治療和超聲分子影像技術研究提供新的實驗依據。本課題主要包括以下三部分內容:第一部分制備攜帶VEGF的靶向載PTX微泡、檢測微泡形態(tài)大小以及與細胞結合能力實驗目的制備一種攜帶VEGF的VTPLLM,檢測其理化性質及與喉鱗癌Hep-2細胞結合能力。方法采用旋轉蒸發(fā)+機械震蕩法制備載VEGF的脂質超聲微泡(PLLMs)及生物素化的脂質超聲微泡(MB-BS),通過生物素-親和素連接法將VEGF抗體連接于MB-BS表面,制備成靶向載藥微泡(VTPLLMs)。采用免疫熒光法檢測脂質載藥微泡VEGF抗體的連接情況,觀察VTPLLMs的分散度、外觀形態(tài),檢測靶向載藥脂質微泡的粒徑大小、濃度、zeta電位、載藥量、包封率等理化性質,觀察其與喉鱗癌Hep-2細胞結合情況,并與非靶向的PLLMs組進行比較。結果VTPLLMs平均粒徑960±20nm,平均濃度為4.07′109/ml,微泡的包封率為81.6%,平均載藥量為33.2%,免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)VTPLLMs表面有綠色環(huán)狀熒光分布,在與喉鱗癌Hep-2細胞結合實驗中發(fā)現(xiàn)靶向載藥微泡組Hep-2細胞周圍有多個呈綠色熒光的VTPLLMs微泡緊密結合,而對照組喉鱗癌Hep-2細胞周圍未發(fā)現(xiàn)綠色熒光粘附。結論成功制備了攜帶VEGF的VTPLLMs,該微泡能夠與Hep-2細胞牢固結合。VTPLLMs有望成為一種新型、高效的喉鱗癌靶向藥物載體。第二部分攜帶VEGF的靶向超聲微泡聯(lián)合UTMD對喉鱗癌Hep-2細胞的增殖、凋亡、細胞周期的影響目的研究VTPLLMs聯(lián)合UTMD對喉鱗癌細胞Hep-2的增殖抑制、細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡的作用,以及Caspase-3、MMP-9、和VEGF的蛋白表達水平和mRNA表達的影響。方法按照《實用細胞培養(yǎng)技術》中所提供的方法培養(yǎng)人喉鱗癌Hep-2細胞,并選取生長狀態(tài)相似的細胞隨機分為6組,分別標記為:對照組(Con)(該組中細胞不做特殊處理,正常培養(yǎng),加處理因素時加入PBS),攜帶VEGF的靶向載PTX微泡+超聲輻照組(VTPLLMs+US),單純紫杉醇藥物組(PTX),紫杉醇+超聲輻照組(PTX+US),空白微泡+US組(MB+US),載PTX微泡+超聲輻照組(PLLMs+US)。在本部分實驗中我們采用MTT檢測PTX對Hep-2細胞的抑制情況;CCK-8法檢測各種處理因素對Hep-2細胞的毒性作用;流式細胞術檢測各種處理因素對Hep-2細胞的周期阻滯情況及誘導細胞凋亡的情況;PCR及Western Blot分別檢測各組處理組Hep-2細胞的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達情況。結果在MTT實驗中發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度增加,Hep-2細胞增殖抑制增加;相同藥物濃度下,隨著培養(yǎng)時間的延長,Hep-2細胞增殖抑制率升高,表現(xiàn)出明顯的時間和濃度效應關系。在CCK-8法檢測細胞毒性實驗中發(fā)現(xiàn):6個實驗組中,VTPLLM+US組對喉鱗癌Hep-2細胞的增殖抑制作用最強(p0.05);流式細胞分析檢測中發(fā)現(xiàn):與其他各處理組進行比較,VTPLLMs+US組對喉鱗癌Hep-2細胞的凋亡誘導作用最強(p0.01),其將喉鱗癌Hep-2細胞周期阻滯于G2/M期的比例最高;同時該組的Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平明顯增高(p0.01),MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(p0.01)。結論VTPLLMs對喉鱗癌Hep-2細胞的生長、增殖有較為明顯的抑制作用,VTPLLMs能夠將喉鱗癌Hep-2細胞周期阻滯于G2/M期,并誘導喉鱗癌細胞發(fā)生凋亡,通過比較分析,和非靶向的PLLMs以及單純PTX相比較,VTPLLMs的作用要明顯強得多。其作用機制可能與凋亡執(zhí)行相關的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達有關。第三部分攜帶VEGF的靶向載藥微泡聯(lián)合UTMD對裸鼠喉鱗癌移植瘤作用和機制的實驗研究目的研究VTPLLMs聯(lián)合UTMD對裸鼠喉鱗癌移植瘤的治療作用和相關機制方法建立裸鼠喉鱗癌皮下移植瘤模型,實驗隨機分為5組,分別是:空白對照組(Con),PTX組(PTX),PTX聯(lián)合超聲組(PTX+US),載PTX微泡聯(lián)合超聲組(PLLMs+US),VEGF靶向載PTX微泡聯(lián)合超聲組(VTPLLMs+US)。測量治療前后各組腫瘤長短徑,繪制裸鼠腫瘤的生長曲線,并計算腫瘤抑制率,TUNEL法檢測各處理組細胞的凋亡情況,免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織MMP-9和VEGF的表達,實時定量熒光PCR及Western Blot分別檢測各組Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達情況。結果各處理組相比較,VTPLLMs+US組對裸鼠喉鱗癌的抑制率最高,其凋亡指數明顯高于其他組(p0.01),增殖指數明顯降低(p0.01),MMP-9和VEGF的表達水平明顯低于其他各組(p0.01)RT-PCR和WB結果顯示:VTPLLMs+US組Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平明顯增高(p0.01),MMP-9和VEGF的蛋白水平明顯低于其他各組(p0.01)。結論VTPLLM對裸鼠喉鱗癌的生長有明顯抑制作用,抑瘤作用強于非靶向的PLLMs和PTX,作用機制與能夠更強的抑制裸鼠腫瘤微小血管生成和浸潤轉移、上調Caspase-3,下調VEGF和MMP-9表達水平有關。VTPLLMs聯(lián)合UTMD具有比非靶向載藥微泡以及單純藥物治療更加有效的喉鱗癌靶向作用和更強的抗腫瘤作用,為喉鱗癌的靶向治療提供了依據。
[Abstract]:The invention relates to a targeted ultrasound contrast agent for treating laryngeal squamous cell carcinoma , which has the advantages of easy decomposition , good safety , no harm to human body and the like . The effects of VTPLLMs combined with UTMD on proliferation , apoptosis and cell cycle of laryngeal squamous cell carcinoma were investigated . The effects of VTPLLMs combined with UTMD on the growth and proliferation of laryngeal squamous cell carcinoma were observed .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.65

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