發(fā)布時(shí)間：2018-05-08 10:55

  本文選題：血管生長(zhǎng)因子(VEGF) + 超聲微泡��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：喉鱗癌排在頭頸部惡性腫瘤第三位。喉癌外科治療歷史已有100多年,但對(duì)于晚期患者和復(fù)發(fā)后失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者,在常規(guī)手術(shù)治療或綜合治療均不能帶來(lái)明顯益處的時(shí)候,或者為了保全喉功能,而不愿意犧牲喉器官的時(shí)候,放化療就顯得尤為重要。但是目前臨床上所使用的很多抗癌藥物在治療過(guò)程中會(huì)引起患者惡心、嘔吐、骨髓抑制、免疫力下降、毛發(fā)脫落,胃腸道功能降低等眾多不良反應(yīng),患者在治療過(guò)程中往往無(wú)法承受這些副作用而中止治療。因此,如何減少這些抗癌藥物對(duì)人體的毒副作用,增加抗腫瘤藥物的療效成為當(dāng)前迫切的任務(wù)和研究熱點(diǎn)。腫瘤靶向治療的研究應(yīng)運(yùn)而生,這種方法能夠根據(jù)腫瘤所表達(dá)的特殊抗體或配體選擇性地將抗藥物或基因運(yùn)送到被識(shí)別出來(lái)的部位,并在一定外力條件或自身性質(zhì)改變條件下將藥物或基因釋放出來(lái),減少在全身循環(huán)中滯留的時(shí)間,從而減少全身不良反應(yīng),提高療效。隨著超聲造影劑的不斷深入研究,以攜帶特定配體為特點(diǎn)的靶向超聲造影技術(shù)使具有靶向作用的微泡能夠識(shí)別并結(jié)合靶點(diǎn),通過(guò)血液聚集到我們希望觀察的組織或器官,并在靶組織或靶器官部位特異性顯影。超聲分子造影劑作為治療藥物載體的腫瘤靶向診斷與治療成為研究熱點(diǎn),為喉鱗癌的治療提供了新的思路。腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)于腫瘤新生血管為它提供所需的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤血管生成相關(guān)的因子大約有30多種。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體在腫瘤血管生成過(guò)程中起著非常重要的作用。隨著對(duì)喉鱗癌細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制研究的不斷深入,促血管生成因子的分子靶向治療為晚期喉鱗癌、喉鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的患者提供了新的治療方式。紫杉醇是從紅豆杉屬植物紫杉的樹(shù)干、樹(shù)皮或針葉中提取開(kāi)發(fā)得到的一種抗微管藥物。目前,PTX已被納入晚期頭頸部鱗癌器官保全性治療方案中。脂質(zhì)微泡因其具有易分解、安全性好、對(duì)人體無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛作為藥物或基因載體用于腫瘤治療等領(lǐng)域,靶向脂質(zhì)微泡是在其表面連接有針對(duì)特異性抗原的抗體或針對(duì)特異性受體的配體,可以有選擇性地到達(dá)相應(yīng)的組織或器官,并與之結(jié)合,使藥物或基因靶向地局部釋放,實(shí)現(xiàn)靶組織或靶器官的精確治療,減少全身循環(huán)中的滯留,從而減少全身毒副作用。本實(shí)驗(yàn)中就是利用超聲微泡載紫杉醇,并使其具有主動(dòng)靶向作用,有針對(duì)性的對(duì)細(xì)胞所表達(dá)的特異性受體作用,從而達(dá)到精確治療的目的。在本實(shí)驗(yàn)中,我們利用靶向超聲分子探針制備技術(shù)和生物素-親和素方法將VEGF與載PTX藥物微泡連接,檢測(cè)VEGF靶向載PTX脂質(zhì)微泡的抗體連接情況和理化性質(zhì),研究靶向載藥微泡與喉鱗癌細(xì)胞的靶向結(jié)合能力,并通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究VTPLLM結(jié)合超聲靶向微泡破裂技術(shù)對(duì)喉鱗癌的作用及相關(guān)機(jī)制,從而為喉鱗癌的靶向治療和超聲分子影像技術(shù)研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題主要包括以下三部分內(nèi)容:第一部分制備攜帶VEGF的靶向載PTX微泡、檢測(cè)微泡形態(tài)大小以及與細(xì)胞結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹苽湟环N攜帶VEGF的VTPLLM,檢測(cè)其理化性質(zhì)及與喉鱗癌Hep-2細(xì)胞結(jié)合能力。方法采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)+機(jī)械震蕩法制備載VEGF的脂質(zhì)超聲微泡(PLLMs)及生物素化的脂質(zhì)超聲微泡(MB-BS),通過(guò)生物素-親和素連接法將VEGF抗體連接于MB-BS表面,制備成靶向載藥微泡(VTPLLMs)。采用免疫熒光法檢測(cè)脂質(zhì)載藥微泡VEGF抗體的連接情況,觀察VTPLLMs的分散度、外觀形態(tài),檢測(cè)靶向載藥脂質(zhì)微泡的粒徑大小、濃度、zeta電位、載藥量、包封率等理化性質(zhì),觀察其與喉鱗癌Hep-2細(xì)胞結(jié)合情況,并與非靶向的PLLMs組進(jìn)行比較。結(jié)果VTPLLMs平均粒徑960±20nm,平均濃度為4.07′109/ml,微泡的包封率為81.6%,平均載藥量為33.2%,免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VTPLLMs表面有綠色環(huán)狀熒光分布,在與喉鱗癌Hep-2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)靶向載藥微泡組Hep-2細(xì)胞周?chē)�有多個(gè)呈綠色熒光的VTPLLMs微泡緊密結(jié)合,而對(duì)照組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞周?chē)�未發(fā)現(xiàn)綠色熒光粘附。結(jié)論成功制備了攜帶VEGF的VTPLLMs,該微泡能夠與Hep-2細(xì)胞牢固結(jié)合。VTPLLMs有望成為一種新型、高效的喉鱗癌靶向藥物載體。第二部分?jǐn)y帶VEGF的靶向超聲微泡聯(lián)合UTMD對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響目的研究VTPLLMs聯(lián)合UTMD對(duì)喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,以及Caspase-3、MMP-9、和VEGF的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)的影響。方法按照《實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》中所提供的方法培養(yǎng)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞,并選取生長(zhǎng)狀態(tài)相似的細(xì)胞隨機(jī)分為6組,分別標(biāo)記為:對(duì)照組(Con)(該組中細(xì)胞不做特殊處理,正常培養(yǎng),加處理因素時(shí)加入PBS),攜帶VEGF的靶向載PTX微泡+超聲輻照組(VTPLLMs+US),單純紫杉醇藥物組(PTX),紫杉醇+超聲輻照組(PTX+US),空白微泡+US組(MB+US),載PTX微泡+超聲輻照組(PLLMs+US)。在本部分實(shí)驗(yàn)中我們采用MTT檢測(cè)PTX對(duì)Hep-2細(xì)胞的抑制情況;CCK-8法檢測(cè)各種處理因素對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各種處理因素對(duì)Hep-2細(xì)胞的周期阻滯情況及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況;PCR及Western Blot分別檢測(cè)各組處理組Hep-2細(xì)胞的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果在MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度增加,Hep-2細(xì)胞增殖抑制增加;相同藥物濃度下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Hep-2細(xì)胞增殖抑制率升高,表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和濃度效應(yīng)關(guān)系。在CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,VTPLLM+US組對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(p0.05);流式細(xì)胞分析檢測(cè)中發(fā)現(xiàn):與其他各處理組進(jìn)行比較,VTPLLMs+US組對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用最強(qiáng)(p0.01),其將喉鱗癌Hep-2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期的比例最高;同時(shí)該組的Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高(p0.01),MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(p0.01)。結(jié)論VTPLLMs對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖有較為明顯的抑制作用,VTPLLMs能夠?qū)⒑眵[癌Hep-2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,并誘導(dǎo)喉鱗癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,通過(guò)比較分析,和非靶向的PLLMs以及單純PTX相比較,VTPLLMs的作用要明顯強(qiáng)得多。其作用機(jī)制可能與凋亡執(zhí)行相關(guān)的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。第三部分?jǐn)y帶VEGF的靶向載藥微泡聯(lián)合UTMD對(duì)裸鼠喉鱗癌移植瘤作用和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究目的研究VTPLLMs聯(lián)合UTMD對(duì)裸鼠喉鱗癌移植瘤的治療作用和相關(guān)機(jī)制方法建立裸鼠喉鱗癌皮下移植瘤模型,實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組,分別是:空白對(duì)照組(Con),PTX組(PTX),PTX聯(lián)合超聲組(PTX+US),載PTX微泡聯(lián)合超聲組(PLLMs+US),VEGF靶向載PTX微泡聯(lián)合超聲組(VTPLLMs+US)。測(cè)量治療前后各組腫瘤長(zhǎng)短徑,繪制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算腫瘤抑制率,TUNEL法檢測(cè)各處理組細(xì)胞的凋亡情況,免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織MMP-9和VEGF的表達(dá),實(shí)時(shí)定量熒光PCR及Western Blot分別檢測(cè)各組Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果各處理組相比較,VTPLLMs+US組對(duì)裸鼠喉鱗癌的抑制率最高,其凋亡指數(shù)明顯高于其他組(p0.01),增殖指數(shù)明顯降低(p0.01),MMP-9和VEGF的表達(dá)水平明顯低于其他各組(p0.01)RT-PCR和WB結(jié)果顯示:VTPLLMs+US組Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高(p0.01),MMP-9和VEGF的蛋白水平明顯低于其他各組(p0.01)。結(jié)論VTPLLM對(duì)裸鼠喉鱗癌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用,抑瘤作用強(qiáng)于非靶向的PLLMs和PTX,作用機(jī)制與能夠更強(qiáng)的抑制裸鼠腫瘤微小血管生成和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、上調(diào)Caspase-3,下調(diào)VEGF和MMP-9表達(dá)水平有關(guān)。VTPLLMs聯(lián)合UTMD具有比非靶向載藥微泡以及單純藥物治療更加有效的喉鱗癌靶向作用和更強(qiáng)的抗腫瘤作用,為喉鱗癌的靶向治療提供了依據(jù)。
[Abstract]:The invention relates to a targeted ultrasound contrast agent for treating laryngeal squamous cell carcinoma , which has the advantages of easy decomposition , good safety , no harm to human body and the like . The effects of VTPLLMs combined with UTMD on proliferation , apoptosis and cell cycle of laryngeal squamous cell carcinoma were investigated . The effects of VTPLLMs combined with UTMD on the growth and proliferation of laryngeal squamous cell carcinoma were observed .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65

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本文編號(hào)：1861106