發(fā)布時(shí)間：2018-05-09 01:42

  本文選題：膀胱癌 + 微小RNA　； 參考：《浙江大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:膀胱癌是危害人類健康的重要問題之一,在世界范圍內(nèi),膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居于第九位,其中,在男性惡性腫瘤中位于第六位,在女性惡性腫瘤中位于第十位以后。我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率與歐美國(guó)家相比相對(duì)較低,但隨著社會(huì)老齡化的加劇、人們生活方式的轉(zhuǎn)變以及新型分子標(biāo)記物和影像學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,近年來我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率及檢出率呈快速上升趨勢(shì)。最新數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)男性膀胱癌發(fā)病率居于所有惡性腫瘤第七位,女性膀胱癌發(fā)病率則居于十五位以外。膀胱癌的腫瘤生物學(xué)行為復(fù)雜,具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),數(shù)據(jù)表明,大約三分之一的初發(fā)膀胱癌會(huì)發(fā)生局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其5年生存期低于62%。遺傳學(xué)改變和環(huán)境改變?cè)诎螂装┑陌l(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,但由于混雜因素眾多,如何研究并從中篩選出潛在方向,以闡明膀胱癌的致病機(jī)理,對(duì)于早期診斷和治療膀胱癌,提高患者生存期具有重要的臨床意義。microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的、內(nèi)源性、非編碼的小RNA分子,這些miRNA通過與靶基因的3'非編碼區(qū)不完全互補(bǔ)配對(duì)以調(diào)控靶基因的表達(dá)。越來越多的研究表明miRNA異常表達(dá)與膀胱癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。目的:在膀胱癌組織以及膀胱癌細(xì)胞株中利用原位雜交及熒光定量PCR法檢測(cè)miR-148a-3p的表達(dá)情況,并進(jìn)一步探索miR-148a-3p表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。采用獲得性功能實(shí)驗(yàn)觀察miR-148a-3p在膀胱癌細(xì)胞系T24和UM-UC-3中的生物學(xué)功能。利用表達(dá)譜芯片、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)尋找并驗(yàn)證miR-148a-3p的直接作用靶點(diǎn),通過分析靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能,驗(yàn)證miR-148a-3p對(duì)其調(diào)控機(jī)制及價(jià)值,并進(jìn)一步探索及研究潛在的下游分子信號(hào)通路。方法:1)通過人膀胱癌組織芯片和microRNA探針原位雜交實(shí)驗(yàn),評(píng)估m(xù)iR-148a-3p在膀胱癌組織中的表達(dá)情況,并分析miR-148a-3p表達(dá)下調(diào)是否和啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān);2)通過轉(zhuǎn)染miR-148a-3p模擬體(mimic)上調(diào)miR-148a-3p表達(dá)量來進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。通過CCK-8、平板克隆形成、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、裸鼠UM-UC-3細(xì)胞株皮下移植瘤模型和Transwell實(shí)驗(yàn)等方法來探索上調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)對(duì)于細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力的影響;3)利用基因芯片和生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-148a-3p的直接作用的下游靶基因進(jìn)行分析和預(yù)測(cè),然后利用熒光定量PCR、Western Blot和免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)靶基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化,并利用熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-148a-3p的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定,并進(jìn)一步使用RNA干擾等實(shí)驗(yàn)來明確靶向調(diào)控關(guān)系和下游機(jī)制。結(jié)果:1)我們發(fā)現(xiàn),癌組織和癌旁組織的miR-148a-3p表達(dá)量存在顯著差異(P0.0001),miR-148a-3p在膀胱癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)。同時(shí),我們利用免疫組化評(píng)估DNMT1在膀胱癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,癌和癌旁組織中的DNMT1染色強(qiáng)度存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,DNMT1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)(P0.0001)。膀胱癌中,miR-148a-3p啟動(dòng)子區(qū)附近的CpG島呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),這與miR-148a-3p在膀胱癌中的低表達(dá)密切相關(guān)。此外,DNMT1作為miR-148a-3p直接作用的靶基因,兩者之間在同一批膀胱癌組織中的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r = 0.108,P = 0.041)。因此我們認(rèn)為,DNMT1和miR-148a-3p在膀胱癌中通過建立一個(gè)正反饋通路來調(diào)節(jié)miR-148a-3p在膀胱癌中的表達(dá)。2)我們發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)量能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、體外克隆形成、促進(jìn)G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,上調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)可抑制裸鼠UM-UC-3細(xì)胞株皮下移植瘤的生長(zhǎng)。miR-148a-3p過表達(dá)可通過抑制AKT2/Snail通路來逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞中的EMT進(jìn)程。這些結(jié)果提示我們miR-148a-3p可能在膀胱癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的抑癌作用。3)我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p可以直接調(diào)控ERBB3基因的表達(dá)。此外,下調(diào)ERBB3的表達(dá)量能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、體外克隆形成、促進(jìn)G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)ERBB3蛋白的表達(dá)量和患者的OS具有顯著相關(guān)性(P=0.026)。我們進(jìn)一步利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析建立模型(包含年齡、性別、病理分級(jí)、臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)來評(píng)估m(xù)iR-148a-3p,ERBB3和DNMT1表達(dá)量與OS的相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn),ERBB3與患者的OS顯著相關(guān)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p的表達(dá)與ERBB3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.149,P =0.017),miR-148a-3p的表達(dá)與DNMT1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.108,P=0.041),DNMT1的表達(dá)與ERBB3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.116,P=0.042)。這些結(jié)果提示我們ERBB3可能在膀胱癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p可以通過靶向AKT2抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。4)我們發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p 通過抑制 ERBB3/AKT2/c-myc 和ERBB3/AKT2/Snail兩條通路,抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。5)我們發(fā)現(xiàn),在過表達(dá)c-myc蛋白的時(shí)候,miR-148a-3p的表達(dá)量發(fā)生明顯下調(diào),也就是說,miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通過建立正反饋調(diào)節(jié)通路調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)論:1)miR-148a-3p在膀胱癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá),其原因可能在于DNMT1和miR-148a-3p通過在膀胱癌中·建立一個(gè)正反饋通路來調(diào)節(jié)miR-148a-3p在膀胱癌中的表達(dá)。2)上調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)量能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、體外克隆形成、促進(jìn)G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力。此外,miR-148a-3p過表達(dá)可通過抑制AKT2/Snail通路來逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞中的EMT進(jìn)程。3)miR-148a-3p過表達(dá)可以顯著抑制其靶基因ERBB3和AKT2的mRNA和蛋白水平,通過抑制ERBB3/AKT2/c-myc和ERBB3/AKT2/Snail兩條通路,進(jìn)一步抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。4)miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通過建立正反饋調(diào)節(jié)通路調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:Background : Bladder cancer is one of the most important problems in human health . In the world , the incidence of bladder cancer is located in the sixth place in all malignant tumors . The incidence of bladder cancer in China is less than 62 % . Results : 1 ) We found that there was a significant difference in the expression of miR - 148a - p in bladder cancer tissues ( P < 0.01 ) . We found that the expression of miR - 148a - 3P can significantly inhibit the proliferation of bladder cancer cells and inhibit the migration and invasion ability . These results suggest that ERBB3 may play an important role in the progression of bladder cancer . At the same time , we find that miR - 148a - 3P can inhibit the proliferation , invasion and migration of bladder cancer cells by targeting AKT2 .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：1864038