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  本文關(guān)鍵詞：UDCA對SMMC-7721人肝細(xì)胞癌株及裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

UDCA對SMMC-7721人肝細(xì)胞癌株及裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究

屈文東  

【摘要】：研究背景與目的肝細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一,外科手術(shù)是對肝癌患者治療的有效手段,無潛在肝功能異常的早期患者可以手術(shù)切除,然而絕大數(shù)肝癌患者,一旦明確診斷,卻往往喪失手術(shù)機(jī)會(huì),此外還有一部分患者,例如存在肝功能差、身體狀況等因素,也不能進(jìn)行外科手術(shù)。當(dāng)前HCC治療手段很多,發(fā)展也很快,除外科手術(shù)切除外,肝移植、局部消融、放射介入、新的分子靶向藥物治療以及姑息性對癥治療等都提供了選擇治療的手段,但是每一種治療方法都有各自的適應(yīng)癥、禁忌癥、獨(dú)特的療效和不良反應(yīng),因此,并不適合所有的患者。從改善患者生存率的角度,探求一種經(jīng)濟(jì)、簡便、不良反應(yīng)少的治療預(yù)防靶向藥物,一直是人們探尋藥物治療的方向和目標(biāo)。熊去氧膽酸是一種無細(xì)胞毒性、親水性的膽汁酸,其生理作用是改變膽汁成分,對膽汁酸有促進(jìn)分泌作用,并溶解膽固醇,參與降低膽汁中膽固醇、膽固醇脂,用于不宜手術(shù)治療的膽固醇結(jié)石,也是治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的一線用藥。其藥理作用是拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒作用,保護(hù)肝細(xì)胞膜；可促進(jìn)內(nèi)源性膽汁酸的分泌,減少重吸收；溶解膽固醇性結(jié)石；并具有免疫調(diào)節(jié)作用。八十年代以后,由于UDCA的細(xì)胞保護(hù)、利膽、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用,應(yīng)用于臨床多種肝膽疾病。COPS5是COP9信號體的第5個(gè)亞單位,發(fā)揮正性調(diào)節(jié)蛋白的作用。研究表明,COPS5在HCC中表達(dá)顯著高于癌旁肝組織及血管瘤旁肝組織。COPS5表達(dá)的上調(diào)可能在HCC的發(fā)生中起重要作用。COPS5也可以誘導(dǎo)腫瘤抑制因子p53從細(xì)胞核至細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位,并促進(jìn)p53的降解。肝細(xì)胞癌的生長和代謝與血管生長有密切關(guān)系,腫瘤血管生成與腫瘤生長浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系,近來研究證實(shí)某些腫瘤抑制基因失活與突變可導(dǎo)致腫瘤血管生成,p53的突變或失活與腫瘤血管生成有密切關(guān)系,p53為一抑癌基因,可以通過多種途徑干預(yù)腫瘤的生長浸潤,同時(shí)影響到腫瘤的預(yù)后。研究表明,UDCA可以減少結(jié)腸癌的發(fā)生,對乳腺癌細(xì)胞株也有誘導(dǎo)凋亡作用,可抑制化學(xué)致癌物對大鼠的致肝癌作用等。因此進(jìn)一步探討UDCA對肝腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖方面的作用及其作用機(jī)制有重要意義。由于UDCA具有上述作用,那么UDCA是否能夠通過COPS5和p53共同的作用機(jī)理而達(dá)到抑制肝細(xì)胞癌的作用值得我們探討。UDCA在體內(nèi)是否具有抗肝細(xì)胞癌作用以及可能的機(jī)制,仍需進(jìn)一步探討。為了驗(yàn)證這一設(shè)想,本課題將UDCA作用于SMMC-7721人肝細(xì)胞癌株及裸鼠移植瘤,觀察UDCA體內(nèi)外抗癌抑制作用,并通過觀察其對COPS5和p53蛋白表達(dá)的影響,探討其機(jī)制,為肝細(xì)胞癌治療提供新的可能治療方案奠定一定理論基礎(chǔ)。第一部分UDCA對SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株生長抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究研究目的1、檢測不同濃度UDCA對SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制作用。2、檢測不同濃度UDCA對SMMC-7721細(xì)胞中COPS5與p53表達(dá)的影響研究方法1、SMMC-7721細(xì)胞、L-02細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。2、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察UDCA對SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制作用。3、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測JDCA對SMMC-7721細(xì)胞中COPS5與p53表達(dá)的影響4、蛋白免疫印跡法檢鋇UDCA對SMMC-7721細(xì)胞中COPS5與p53表達(dá)的影響結(jié)果1、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察UDCA對SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制作用(1) SMMC-7721與UDCA共培養(yǎng)48小時(shí)后,低劑量組計(jì)數(shù)細(xì)胞為7.42±0.14×105個(gè)/ml,高劑量組為5.16±0.10×105個(gè)/ml,對照組計(jì)數(shù)細(xì)胞11.89±0.24×105個(gè)/ml,顯示UDCA對SMMC-7721抑制效應(yīng)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與對照組比較,P0.001),而L-02細(xì)胞無顯著差異(P0.05)。(2)以對照組作為參照,計(jì)算實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞株細(xì)胞數(shù)下降抑制程度與對照組比值,SMMC-7721低劑量組細(xì)胞抑制率為37.59±0.78%,高劑量組細(xì)胞抑制率為56.60±1。35%,高劑量組抑制率高于低劑量組,高劑量組與低劑量組比較有顯著差異(P0.01)；L-02細(xì)胞各劑量組無明顯變化(P0.05)。2、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測UDCA對SMMC-7721細(xì)胞中COPS5與p53表達(dá)的影響(1)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SMMC-7721細(xì)胞中COPS5主要定位于細(xì)胞核,胞漿中也可見部分表達(dá),經(jīng)UDCA處理后,其細(xì)胞核中熒光強(qiáng)度減弱,胞漿中較為分散。p53主要定位于細(xì)胞核,經(jīng)UDCA處理后,其熒光強(qiáng)度較對照組顯著增強(qiáng)。(2)計(jì)算兩種蛋白的相對熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示,與對照組比較,低劑量組、高劑量組中SMMC-7721細(xì)胞中COPS5:相對熒光強(qiáng)度分別為0.42±0.008、0.22±0.005均低于對照組(P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著UDCA濃度增加COPS5相對熒光強(qiáng)度呈減弱趨勢。低劑量組、高劑量組中SMMC-7721細(xì)胞中p53相對熒光強(qiáng)度分別為1.26±0.023、1.34±0.031均高于對照組(P0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著UDCA濃度增加,p53相對熒光強(qiáng)度呈增高趨勢。3、蛋白免疫印跡法檢測UDCA對SMMC-7721細(xì)胞中COPS5與p53表達(dá)的影響(1)隨著UDCA濃度增高,COPS5的表達(dá)逐漸減弱,為進(jìn)一步確定COPS5與p53表達(dá)情況,經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參比較分析,0.4 mmol/L組相對值與對照組比較P0.001,差異有顯著性,1.0mmol/L組相對值與對照組比較P0.001,差異有顯著性。隨著UDCA濃度增高,COPS5的表達(dá)呈減弱趨勢。(2)隨著UDCA濃度增高,p53表達(dá)逐漸增強(qiáng),經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參比較分析,0.4 mmol/L組相對值與對照組比較P0.001,差異有顯著性,1.0 mmol/L組相對值與對照組比較P0.001,差異有顯著性；結(jié)果提示,SMMC-7721細(xì)胞中隨著UDCA治療濃度升高,p53表達(dá)逐漸增強(qiáng)。結(jié)論1、UDCA可抑制SMMC-7721人肝細(xì)胞癌株的生長。2、UDCA作用SMMC-7721人肝細(xì)胞癌株的機(jī)制與調(diào)控COPS5與p53有關(guān),可以通過上調(diào)p53表達(dá),下調(diào)COPS5的表達(dá),阻滯細(xì)胞增殖生長。第二部分UDCA對裸鼠移植瘤生長抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究研究目的1、裸鼠移植瘤的制備2、檢測不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤的生長抑制作用。3、檢測不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤組織的影響。4、檢測不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤中COPS5與p53表達(dá)的影響研究方法1、SMMC-7721細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。2、制備二代裸鼠移植瘤模型。3、觀察不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤生長曲線的影響。4、觀察不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤組織壞死的影響5、免疫組化檢測不同濃度UDCA對裸鼠移植瘤中COPS5與p53表達(dá)的影響。6、蛋白免疫印跡法檢測UDCA對裸鼠移植瘤中COPS5與p53表達(dá)的影響。結(jié)果1、UDCA對裸鼠生長曲線的影響。UDCA能夠明顯抑制肝移植瘤的生長,治療組腫瘤生長曲線為非指數(shù)生長,增長較緩慢,表現(xiàn)為隨藥物濃度增高抑制生長作用增強(qiáng)趨勢。2、移植瘤組織病理學(xué)觀察。移植瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,對照組瘤組織以輕度壞死為主,經(jīng)治療后,腫瘤壞死組織明顯增加,UDCA高劑量組可見大片壞死組織,等級秩和檢驗(yàn)X2=11.68,P0.05,提示壞死組織與UDCA劑量有相關(guān)關(guān)系,全部實(shí)驗(yàn)裸鼠未見移植瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。3、移植瘤組織COPS5、p53免疫組化結(jié)果光鏡觀察,對照組視野中可見細(xì)胞核呈棕黃色染色的腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,經(jīng)UDCA處理腫瘤組織,細(xì)胞核中COPS5棕黃色染色細(xì)胞數(shù)量減少,呈淡藍(lán)色細(xì)胞核、細(xì)胞漿細(xì)胞數(shù)量較多,細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,而p53陽性細(xì)胞隨UDCA濃度增高成增多趨勢。4、Western blot檢測結(jié)果經(jīng)UDCA處理后,裸鼠移植瘤組織中COPS5與p53表達(dá)情況如下：隨著UDCA濃度增高,COPS5的表達(dá)逐漸減弱,而p53表達(dá)逐漸增強(qiáng)。為進(jìn)一步確定COPS5與p53表達(dá)情況,經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參比較分析,90 mg/kg組相對值與對照組比較P0.05,差異有顯著性,270 mg/kg組相對值與對照組比較P0.05,差異有顯著性。結(jié)果提示,裸鼠移植瘤組織COPS5隨著治療濃度升高而減弱,而p53表達(dá)逐漸增強(qiáng)。結(jié)論1、UDCA可選擇性抑制裸鼠移植瘤的生長。2、UDCA可促進(jìn)裸鼠移植瘤腫瘤組織壞死。3、UDCA抑制裸鼠移植瘤生長的機(jī)制與調(diào)控COPS5與p53有關(guān),可以通過上調(diào)p53表達(dá),下調(diào)COPS5的表達(dá),阻抑瘤細(xì)胞生長。4、UDCA可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)性裸鼠肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

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本文編號：194151