發(fā)布時間：2017-12-20 02:12

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲pSMART2b-SAG3 DNA疫苗的研制及其初步應用　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：弓形蟲病(toxoplasmosis)是由胞內(nèi)寄生的剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的一種能引起懷孕婦女及懷孕母畜流產(chǎn)等嚴重危害的人獸共患病,在中國是二類動物傳染病。且目前用于防治弓形蟲病的藥物主要是磺胺類藥物與抗菌增效劑,長期使用藥物對公共衛(wèi)生安全影響很大,同時在國內(nèi)用于預防和控制弓形蟲病的疫苗暫時沒有,為解決這一現(xiàn)狀,本研究以RH株弓形蟲SAG3基因為抗原分子,并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3,且以兔抗SAG3蛋白血清證明了該基因所表達蛋白具有免疫原性,然后對小鼠后肢肌肉進行注射重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3,最后檢測其細胞免疫和體液免疫的情況,并分析其對小鼠抗RH株弓形蟲速殖子攻擊后的保護效果,以此來初步探索該重組質(zhì)粒作為DNA疫苗的潛力。重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3構(gòu)建、表達和鑒定將RH株弓形蟲速殖子純化后,通過Trizol法提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄為c DNA,然后以該c DNA為模板擴增SAG3基因的CDS,成功擴增出了除掉信號肽部分的SAG3基因,大小為1068bp,接著成功連接p MD-18T克隆載體和甲病毒復制子載體pSMART2b,生物測序結(jié)果均為100%,最后將重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3及載體pSMART2b轉(zhuǎn)染入293T細胞并用兔抗SAG3蛋白血清證明了其蛋白具有良好的免疫原性。重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3對小鼠抗弓形蟲效果研究將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3及空載體pSMART2b經(jīng)小鼠后肢肌肉注射,免疫劑量分別為50μg/只和100μg/只,三次免疫后檢測、評估其細胞及體液免疫情況,MTT法檢測小鼠脾臟淋巴細胞增殖情況及流式細胞儀檢測CD4+和CD8+含量變化,統(tǒng)計分析各組體重變化、存活率,最后針對肺臟基因組進行實時熒光定量蟲子數(shù)量。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒免疫小鼠后,隨著免疫次數(shù)的增加其抗體滴度、IL-2、IFN-γ、SI以及CD4+和CD8+數(shù)量均逐漸升高,且較對照組差異明顯;免疫結(jié)束后,用RH株弓形蟲1×103個/只攻擊小鼠(除陰性對照),攻蟲后2周內(nèi)以pSMART2b-SAG3(50μg)組的存活率為最高(18.75%),pSMART2b-SAG3(100μg)組的存活率為6.25%,其余組均無存活;同時經(jīng)統(tǒng)計分析顯示試驗組小鼠的平均體重較對照組體重減少緩慢;并且重組質(zhì)粒50μg/只較100μg/只的劑量免疫注射小鼠后的免疫保護效果更佳;最后通過絕對實時熒光定量各組肺臟弓形蟲速殖子數(shù)目,結(jié)果pSMART2b-SAG3(50μg)組為105.02個,比陽性對照降低25.95%�？傊�,重組質(zhì)粒pSMART2b-SAG3對小鼠抗弓形蟲感染能起到一定的保護效果。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1310350