發(fā)布時(shí)間：2020-12-10 13:56

　　木材資源對(duì)于整個(gè)人類社會(huì)具有不可缺少的重要意義。木材作為燃燒能源以及在造紙和建筑方面具有不可缺少的重要地位,樹木的大部分生物量是木材,木材也稱次生木質(zhì)部。次生生長過程中維管形成層向內(nèi)分化產(chǎn)生次生木質(zhì)部,向外分化產(chǎn)生次生韌皮部,后續(xù)經(jīng)歷細(xì)胞膨脹擴(kuò)增,次生壁沉積,細(xì)胞程序性死亡等一系列復(fù)雜發(fā)育過程使樹干增粗,因此植物次生生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的科研價(jià)值。本研究通過分析前期的基因表達(dá)數(shù)據(jù)選定LBD基因家族中的LBD21-31（Potri.010G186000）基因?yàn)檠芯繉?duì)象,以雜交楊樹84K為實(shí)驗(yàn)材料,克隆得到楊樹LBD21-31基因片段,并成功構(gòu)建35S::LBD21-31過表達(dá)載體,使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤侵染轉(zhuǎn)化技術(shù)侵染得到LBD21-31過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株,通過RT-qPCR檢測了LBD21-31在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量,后續(xù)通過表型分析和植株莖段切片觀察分析了LBD21-31對(duì)楊樹愈傷發(fā)育、根系發(fā)育及次生木質(zhì)部發(fā)育的影響,使用DAP-seq分析了與LBD21-31直接作用的靶基因,為LBD基因家族研究和楊樹良種選育提供了重要的理論依據(jù),現(xiàn)有主要研究結(jié)果如下:（1）LBD21-31基... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

楊樹木材形成過程中次生細(xì)胞壁轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1-1Thetranscriptionalnetworkregulatingsecondarywallbiosynthesisduringwoodformationinpoplar

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文11qPCRMasterMix：購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、DNaseI酶、RNaseI酶：購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒：購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnI，XbaI、T4連接酶：購自于賽默飛世爾科技公司（ThermoFisherScientific）。光照培養(yǎng)箱型號(hào)GXZ-500C，品牌：寧波江南；小型冷凍高速離心機(jī)型號(hào)5424R，品牌：Eppendor；PCR儀型號(hào)LabcyclerGradient96，品牌：SENSOQUEST；凝膠成像分析儀型號(hào)TANON1600R，品牌：上海天能。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1LBD21-31過表達(dá)載體的構(gòu)建2.2.1.1LBD21-31基因序列和載體圖譜通過毛果楊基因數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）輸入LBD21-31基因號(hào)Potri.010G186000查詢得到毛果楊LBD21-31的CDS序列。選取的過表達(dá)載體為PzP211+35s+PolyA，載體大小9014bp，其中啟動(dòng)子為CaMV35S，菌體培養(yǎng)過程中抗性為大觀霉素（Spe），在轉(zhuǎn)基因植株中抗性為卡那霉素（Kana）。圖2-1PzP211+35S載體圖譜Fig.2-1PzP211+35Svector

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文27IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),在離心管中加入2mlLB和2μLAMP抗生素，混合均勻后加入200μL轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌（DE3）菌液，搖床恒溫37℃條件下180rpm培養(yǎng)24h。準(zhǔn)備無菌錐形瓶，在錐形瓶中加入250mlLB和250μLAMP抗生素，混合均勻后加入2ml菌液。搖床恒溫37℃條件下180rpm培養(yǎng)至OD600值約為0.5，15℃條件下靜置30min，加IPTG至0.5mM，15℃條件下誘導(dǎo)24h。將誘導(dǎo)24h之后的蛋白菌液分裝在50ml離心管中，離心機(jī)4℃條件下12000g離心5min，離心過程中將錐形瓶置于冰上。離心結(jié)束后吸干凈離心管內(nèi)壁附著的的LB液體，把離心后的菌體連同離心管一同放入-80℃冰箱保存。（3）基因蛋白互作使用磁珠（BeaverBeadsGSH）對(duì)蛋白菌液進(jìn)行純化，詳細(xì)步驟見說明書。使用第一步提取的DNA，根據(jù)其濃度取100ngDNA加水至40μL。再取定量蛋白磁珠加PBS溶液至40μL，與40μL的DNA溶液混勻后制成80μL反應(yīng)液。在20℃恒溫150rpm條件下晃動(dòng)1h。結(jié)合完成后將離心管置于磁力架上，等待吸附完成后棄上清液，保留沉淀。將沉淀使用PBST緩沖液洗五遍后，更換新的離心管，使用27μLEB懸浮沉淀，水浴鍋98℃水浴10min。水浴完成后置于冰上冷卻5min，離心機(jī)3000g條件下離心5s，離心管放置磁力架上，吸附完成后吸出上清液，取約25μL作為模板用于PCR擴(kuò)增。割膠回收DNA后，提交DAP-seq文庫，使用illumina方法進(jìn)行高通量測序，每個(gè)樣品準(zhǔn)備了三個(gè)重復(fù)。圖2-2pCold-GST載體圖譜Fig.2-2pCold-GSTvector

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]毛果楊LBD基因家族的全基因組分析[J]. 蘆強(qiáng),邵芬娟,邱德有.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2018(01)
[5]84K楊愈傷組織再生體系和直接分化再生體系遺傳轉(zhuǎn)化的比較性研究[J]. 王麗娜,王玉成,楊傳平.  植物研究. 2017(04)
[6]植物MYB轉(zhuǎn)錄因子功能及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 左然,徐美玲,柴國華,周功克.  生命科學(xué). 2012(10)
[7]植物的次生生長及其分子調(diào)控[J]. 田敏,夏瓊梅,李紀(jì)元.  遺傳. 2007(11)
[8]84K楊再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J]. 李科友,樊軍鋒,趙忠,周永學(xué),高建社.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2007(07)
[9]84K楊葉片再生系統(tǒng)的建立[J]. 王樹耀,田宗城,黃白紅,徐艷.  湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2004(04)

碩士論文
[1]84K楊再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D]. 周熙瑩.東北林業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：2908808