發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 19:42

　　 細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)是依賴于種群密度的細(xì)菌之間的信息交流。群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)自由生活細(xì)菌的群體行為,也可調(diào)控與宿主之間的相互作用。大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110能與大豆形成根瘤,具有優(yōu)良的共生固氮特性。對(duì)該根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行研究,有助于加深對(duì)大豆-根瘤菌共生固氮體系的認(rèn)識(shí),為根瘤菌的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù),也對(duì)全球氮生態(tài)循環(huán)研究具有重要的意義。本論文以大豆慢生型根瘤菌模式菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110(B.d 110)為研究對(duì)象,探究了染色體上LuxI-LuxR型群體感應(yīng)基因blr1062(bjaR1)-blr1063(bjaI)在根瘤菌共生中的生物學(xué)作用。研究結(jié)果如下:1.blr1062調(diào)節(jié)基因與blr1063結(jié)構(gòu)基因作為一個(gè)操縱子發(fā)揮功能,相互之間進(jìn)行環(huán)式調(diào)控;blr1063基因的表達(dá)受到大豆金雀異黃酮(Genistein)誘導(dǎo),但是被大豆種子浸提液(SSE)顯著抑制。與野生株相比,blr1062突變株在半固體豐富培養(yǎng)基(YMB)上運(yùn)動(dòng)性顯著增強(qiáng)48.3%,表明blr1062突變有利于根瘤菌快速在大豆植株根部定殖,以形成根瘤。2.與大豆的接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與野生株相比,blr1062突變株接種的大豆在側(cè)根上的根瘤數(shù)增加,總根瘤數(shù)與根瘤干重略有提高,固氮酶活性及根系表面積分別顯著增加82.6%和9.9%,表明blr1062的突變有利于結(jié)瘤固氮。這也進(jìn)一步表明,Blr1062可能是作為負(fù)調(diào)控因子參與這些共生固氮過(guò)程。3.在綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了B.d 110中參與結(jié)瘤調(diào)控關(guān)鍵基因的lacZ報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄融合體。相較于野生株,blr1062突變株中參與負(fù)調(diào)控結(jié)瘤數(shù)的nwsA、nolA與nodD2調(diào)控基因,特別是后兩者的表達(dá)顯著降低,而參與結(jié)瘤因子合成的結(jié)構(gòu)基因nodY的表達(dá)顯著增強(qiáng);與此相反,正調(diào)控結(jié)瘤數(shù)的nodD1、nodW等基因的表達(dá)差異不明顯。此外,blr1062的突變降低了三型分泌系統(tǒng)中相關(guān)基因(ttsI與rhcN)的表達(dá),但是差異不明顯。這些結(jié)果表明,群體感應(yīng)系統(tǒng)可能通過(guò)NolA以及NodD2參與負(fù)調(diào)控根瘤菌結(jié)瘤過(guò)程,這也與接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。4.轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,上述參與結(jié)瘤調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)與通過(guò)lacZ報(bào)告基因獲得的結(jié)果基本相一致。此外,blr1062的缺失突變使得KEGG富集中大量參與氮代謝通路上相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。在添加不同氮源的最小液體培養(yǎng)基中,blr1062突變體菌株與野生體菌株生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯差異,表明群體感應(yīng)系統(tǒng)可能參與根瘤菌的氮代謝過(guò)程,從而影響固氮酶活性,但是機(jī)理不清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示,盡管差異蛋白的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組獲得的差異基因的結(jié)果并不相關(guān),但是KEGG通路富集中,參與群體感應(yīng)系統(tǒng)的大量基因在翻譯水平顯著上調(diào)。此外,氮代謝過(guò)程中,只有谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶的蛋白表達(dá)顯著下調(diào),并得到酶活性分析的驗(yàn)證支持。綜合以上結(jié)果,大豆慢生型根瘤菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能通過(guò)NodD2參與根瘤菌負(fù)調(diào)控結(jié)瘤,并且參與氮代謝過(guò)程,從而影響根瘤菌的固氮作用。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過(guò)程中的功能研究2于植物根系，根毛彎曲，隨后根瘤菌侵入根毛。根瘤菌進(jìn)入植物體后，經(jīng)歷一個(gè)分化過(guò)程，開始表達(dá)固氮酶以及其它固氮所必需的基因，從而給植物提供氮源[5]。根瘤菌與大豆發(fā)生共生結(jié)瘤一般包含以下幾個(gè)過(guò)程：（1）根瘤菌感知到豆科植物根系分泌到根際的信號(hào)分子例如類黃酮化合物（圖1.1a），誘導(dǎo)細(xì)菌調(diào)節(jié)蛋白NodD激活參與菌株特異性信號(hào)分子合成的nod（結(jié)瘤）基因轉(zhuǎn)錄（也被稱為Nod因子/NFs）；（2）根瘤菌附著在根毛的頂端，分泌NFs，開啟根瘤發(fā)育過(guò)程，包括根毛變形和皮層內(nèi)根瘤原基的形成（圖1.1b）；（3）根毛頂端的根瘤菌進(jìn)入卷曲的根毛中形成感染線，之后在根毛內(nèi)部伸長(zhǎng)，穿過(guò)多個(gè)細(xì)胞層，到達(dá)正在發(fā)育的根瘤原基[6]（圖1.1c-f）；（4）根瘤菌通過(guò)一種類似內(nèi)吞作用的機(jī)制侵入植物細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞擴(kuò)大，形成稱為共生體的細(xì)胞器樣結(jié)構(gòu)（圖1.1g）開始固氮[7]；（5）根瘤菌DNA在入侵的植物細(xì)胞中復(fù)制，而被感染的植物細(xì)胞則成為擁有數(shù)千個(gè)共生體的大型多倍體細(xì)胞[8]；（6）有限根瘤無(wú)持續(xù)的分生組織，變成球狀（圖1.1h-j），成熟的共生體包含多個(gè)正常大小的類菌體；（7）根瘤開始從中心衰老，并延伸到周圍[9]，從解體的根瘤菌釋放進(jìn)入下一個(gè)生命周期（圖1.1k）。圖1.1有限根瘤形成過(guò)程[10]Fig1.1Theprocessoflimitednoduleformation大豆植物與根瘤菌的共生固氮體系具有很高的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益，共生系統(tǒng)的建立涉及雙方信號(hào)物質(zhì)的交流。對(duì)共生固氮過(guò)程中根瘤菌與大豆如何進(jìn)行信號(hào)傳遞，以促進(jìn)雙方的生長(zhǎng)與發(fā)展的研究具有重大意義，同時(shí)也為進(jìn)一步促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)文明建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。1.2群體感應(yīng)系統(tǒng)介紹1.2.1細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)細(xì)菌在

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過(guò)程中的功能研究6圖1.2群體感應(yīng)系統(tǒng)中有關(guān)的信號(hào)通路[44]Fig1.2Relatedsignalpathwaysinquorumsensingsystem2011年在B.d110中發(fā)現(xiàn)了一處參與群體感應(yīng)信號(hào)分子合成的基因位點(diǎn)：bjaI，它的多肽序列與兩種AHL合成酶（BtaI和RpaI）密切相關(guān)，并產(chǎn)生了一種獨(dú)特的高絲氨酸內(nèi)酯（HSL），此信號(hào)分子不是BtaI和RpaI產(chǎn)生的芳基-HSL，而是支鏈脂肪�；�-HSL，即異戊酰基高絲氨酸內(nèi)酯（IV-HSL）。參與信號(hào)分子合成與調(diào)控基因位點(diǎn)是bjaR1和bjaI（圖1.3）。其中結(jié)構(gòu)基因bjaI（blr1063）是LuxI家族同源物，編碼產(chǎn)生的IV-HSL合成酶不像其他脂肪�；�-HSL合酶選擇�；�-ACP作為活化的脂肪酸底物，而是利用�；�-CoA作為酰基載體，催化合成IV-HSL。因此AHL合成酶亞家族，包括RpaI，BtaI和BjaI[45]。調(diào)節(jié)基因bjaR1（blr1062）是LuxR家族同源物，可與低密度的IV-HSL結(jié)合，激活下游基因表達(dá)。細(xì)菌通常需要納摩級(jí)信號(hào)濃度[46]來(lái)激活下游基因，但B.d110產(chǎn)生的IV-HSL大約是2-10nM，而IV-HSL濃度為10pm就可誘導(dǎo)bjaR1基因的表達(dá)，表明IV-HSL的產(chǎn)生量能夠建立一個(gè)群體感應(yīng)信號(hào)通路[45]，雖然誘導(dǎo)bjaI表達(dá)的基礎(chǔ)水平低，但通過(guò)外源添加IV-HSL可使bjaI基因表達(dá)增強(qiáng)約20倍，并且B.d110不需要外源底物來(lái)產(chǎn)生IV-HSL。CarolineS.Harwood等人雖然分離純化了自誘導(dǎo)物IV-HSL，并首次闡明了該位點(diǎn)作為L(zhǎng)uxR/LuxI型群體感應(yīng)效應(yīng)系統(tǒng)的一些獨(dú)特性，但是B.d110是共生固氮細(xì)菌，此群體感應(yīng)的兩個(gè)基因位點(diǎn)bjaR1（blr1062）-bjaI（blr1063）是否以及如何參與共生沒(méi)有研究。因此本文對(duì)此位點(diǎn)的基因功能進(jìn)行了探究。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應(yīng)系統(tǒng)在共生過(guò)程中的功能研究7圖1.3bjaR1-bjaI基因位點(diǎn)[45]Fig1.3ThegenelocusofbjaR1-bjaI1.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和目的、意義1.3.1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和目的本研究主要內(nèi)容包括：（1）群體感應(yīng)系統(tǒng)表達(dá)模式分析，blr1062缺失突變對(duì)大豆植株的共生固氮影響；（2）利用lacZ報(bào)告基因，比較探究blr1062突變株與野生株中，調(diào)控結(jié)瘤基因表達(dá)信號(hào)通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)模式；（3）利用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組學(xué)手段，從全基因組水平，分析blr1062突變帶來(lái)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)變化。研究目的：圍繞參與群體感應(yīng)的兩個(gè)基因（blr1062與blr1063），在構(gòu)建缺失突變株基礎(chǔ)上，構(gòu)建功能回復(fù)株及相關(guān)的lacZ融合菌株，探究此基因位點(diǎn)是否影響共生，闡明此位點(diǎn)缺失對(duì)于和結(jié)瘤基因有關(guān)的信號(hào)通路的影響，同時(shí)運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組學(xué)初步挖掘影響共生的機(jī)制。1.3.2研究意義多個(gè)國(guó)家在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨為提高產(chǎn)量長(zhǎng)期使用化學(xué)施肥，造成土壤結(jié)塊、耕地質(zhì)量下降、生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞等一系列問(wèn)題。為了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及大自然與人的和諧相處[47]，具有高效固氮能力的根瘤菌可應(yīng)用于生產(chǎn)，不僅可以增強(qiáng)大豆結(jié)瘤固氮能力，而且能減少使用氮肥帶來(lái)的生態(tài)環(huán)境污染問(wèn)題。為更好地提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量，減少對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的傷害，許多國(guó)家包括中國(guó)正致力于研發(fā)高質(zhì)量菌株，促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展。在根瘤菌中，B.d110由于能與大豆形成根瘤且具有優(yōu)良的共生固氮特性成為最重要的農(nóng)業(yè)物種，被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)。影響根瘤菌和宿主植物相互作用的一個(gè)重要因素是群體感應(yīng)系統(tǒng)，長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于群體感應(yīng)基因的功
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3 王玉峰,李富;提高大豆接種根瘤菌有效性的技術(shù)措施[J];農(nóng)民致富之友;1997年06期

4 竇新田;李曉鳴;;應(yīng)用免疫血清研究大豆接種根瘤菌的有效性[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);1985年05期

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6 關(guān)興照,李成泰,張朝清,石桂芳;大豆施氮肥接種根瘤菌效果研究[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年04期

7 劉發(fā),張永庫(kù),張振江,劉英華,陳質(zhì)清,侯殿孝,萬(wàn)麗華;黑龍江省北部高寒地區(qū)大豆接種根瘤菌的效果與應(yīng)用技術(shù)[J];大豆科學(xué);1986年03期

8 Branden J.Furseth;Shawn P.Conley;Jean-Michel Ané;孫明明;;美國(guó)威斯康星州大豆對(duì)土著根瘤菌及根瘤菌促生劑的反應(yīng)[J];大豆科學(xué);2012年02期

9 卜常松,張學(xué)江,江木蘭,胡小加;單株根系來(lái)源的土著大豆慢生根瘤菌多樣性[J];生物多樣性;1996年04期

10 ;大豆接種根瘤菌增產(chǎn)效果試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)[J];江西農(nóng)業(yè)科技;1981年02期

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