發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 12:46

　　 黑果枸杞為重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)型多棘刺灌木,其無(wú)刺類型更易做經(jīng)濟(jì)型林木栽培。本研究通過(guò)植物組織培養(yǎng)、盆栽稱重控水、掃描電鏡(SEM)觀察、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和高效液相色譜(HPLC)等方法,研究黑果枸杞枝刺發(fā)生規(guī)律并探索可能影響其枝刺發(fā)生的因素。主要研究結(jié)果如下:(1)黑果枸杞花苞外植體采用75%酒精處理45 s聯(lián)合0.1%HgCl_2處理3 min時(shí),殺菌效果最好;以MS為基本培養(yǎng)基,添加6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L時(shí),外植體的再生效果最好;以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,添加0.2 mg/L IBA時(shí)最適合根誘導(dǎo),生根率可達(dá)100%;以篩選出的再生效果最好的培養(yǎng)基作為外植體解除玻璃化的基本培養(yǎng)基,接種于添加40μM AgNO_3培養(yǎng)基中的芽叢脫玻璃化率最高。(2)同一無(wú)性系的黑果枸杞植株,田間持水量在80%以上可以表現(xiàn)為整株無(wú)枝刺,在60%以下均發(fā)育出枝刺。利用SEM對(duì)黑果枸杞的無(wú)刺及有刺材料進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑果枸杞的刺起源于葉腋處的腋生分生組織,表明黑果枸杞的刺為枝刺,同時(shí)確定其枝刺發(fā)育的3個(gè)時(shí)期(無(wú)刺期、刺啟動(dòng)期和刺形成期)。為后續(xù)試驗(yàn)樣品的采集奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞的葉原基、葉片和包刺葉狀結(jié)構(gòu)表面有功能未知的柱狀凸起。(3)對(duì)無(wú)刺期(CK)、刺啟動(dòng)期(Init)和刺形成期(Form)的黑果枸杞短莖節(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共產(chǎn)生Clean Data 62.33 Gb,拼接出Unigenes52 816條,注釋到七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)上的Unigenes總數(shù)為32 000個(gè),占總Unigenes的60.59%。分析發(fā)現(xiàn)CK與Init之間有1 208個(gè)DEGs,主要顯著富集在氧化還原活性、S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性等GO條目以及類黃酮生物合成KEGG路徑。Init與Form之間有2 828個(gè)DEGs,主要富集在氧化還原活性、氧化還原進(jìn)程等GO條目以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG路徑。這兩組比較的DEGs共同顯著富集的GO條目有74個(gè),共同顯著富集到的KEGG路徑有5個(gè),分別為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、苯丙氨酸生物合成路徑、類黃酮生物合成路徑、苯丙氨酸代謝路徑和植物晝夜節(jié)律。此外,我們關(guān)注到Init和Form之間的DEGs顯著富集在淀粉和蔗糖代謝KEGG路徑,CK與Init之間的DEGs有3個(gè)注釋到該KEGG路徑。該KEGG路徑有一DEG(蔗糖合酶基因)在刺啟動(dòng)期呈現(xiàn)顯著性低表達(dá);HPLC測(cè)定顯示蔗糖含量在刺啟動(dòng)期極顯著低于無(wú)刺期和刺形成期。三種材料蔗糖合酶基因表達(dá)與蔗糖含量呈極顯著正相關(guān),與葡萄糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。參照植物側(cè)枝發(fā)育的相關(guān)研究結(jié)果,我們推測(cè)淀粉和蔗糖代謝KEGG路徑與黑果枸杞枝刺發(fā)生相關(guān),蔗糖為調(diào)控黑果枸杞枝刺發(fā)生的信號(hào),葡萄糖為枝刺發(fā)生提供能量,蔗糖合酶參與蔗糖對(duì)枝刺發(fā)生的調(diào)控。本研究為揭示黑果枸杞枝刺發(fā)生機(jī)理及培育無(wú)刺黑果枸杞品種奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S567.19
【部分圖文】：

第二章黑果枸杞離體快繁體系的建立18表2-1不同消毒處理的平均污染率及死亡率統(tǒng)計(jì)Table2-1Statisticsofaveragepollutionrateanddeadrateofdifferentdisinfectiontreatments注：方差分析采用LSD法；字母a代表顯著性分析結(jié)果（P<0.05）圖2-1黑果枸杞的組織培養(yǎng)及移栽馴化Fig.2-1PlanttissuecultureandtransplantingofL.ruthenicumA.接種的幼花苞外植體；B.培養(yǎng)8d時(shí)花冠和子房外植體切口處均開始產(chǎn)生黃白色疏松愈傷組織；C.培養(yǎng)30d觀察到的疏松愈傷組織；D.愈傷組織出現(xiàn)大量芽點(diǎn)并發(fā)生玻璃化現(xiàn)象；E.愈傷組織再分化形成大量芽叢；F.莖段外植體產(chǎn)生芽叢并誘導(dǎo)生根；G.用于移栽的組培苗；H.經(jīng)煉苗并成活的組培植株。A.Inoculatedyoungflowerbudexplants;B.Atthe8thdayofthePlantTissueCulture,yellow-whiteloosecallusbegantoappearattheincisionofcorollaandovaryexplants;C.Loosecallusobservedafter30daysofthePlantTissueCulture;D.Greenbudswereproducedonthecallusandhyperhydricitionoccurred;E.Callusredifferentiationandbudsformation;F.Stemexplantsproducedbudsandinducderootformation;G.Plantletsafteracclimatization;H.Plantletsaftertransplantation.酒精處理時(shí)間（s）氯化汞處理時(shí)間（min）污染率（%）死亡率（%）污染率+死亡率（%）30232.50±9.55ab0.00±0.00b32.50±9.55a45253.06±13.17a0.00±0.00b53.06±13.17a3030.00±0.00b39.38±8.89a39.38±8.89a4530.00±0.00b25.71±10.43a25.71±10.43a30421.77±4.80ab36.70±4.11a58.47±7.04a45428.54±5.92ab7.69±1.60b36.23±5.52aACDFGHBE

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文192.2.2以幼葉片和莖段為外植體的組織培養(yǎng)根據(jù)觀察，在接種19d時(shí)，以葉片為外植體的部分長(zhǎng)出大量叢生幼芽；接種23d，葉片為外植體的部分長(zhǎng)出的幼芽逐漸變?yōu)榫G色并且伸長(zhǎng)，葉片外植體的脫分化率100%，再分化率為91.67%，接種30d，平均每塊外植體出芽9.62個(gè)；接種25d，莖外植體開始產(chǎn)生芽，莖外植體的脫分化率為100%，再分化率為83.33%，接種30d，平均每塊外植體發(fā)芽5個(gè)。其中以葉片為外植體產(chǎn)生的芽叢52%出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，以莖為外植體的材料沒(méi)有產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。2.2.3利用AgNO3解除芽叢玻璃化帶有玻璃化芽叢的愈傷組織置于透氣良好的無(wú)菌空瓶中，16-50d材料表面干燥，干燥所需時(shí)間取決于材料本身的大小，材料越小干燥所需要的時(shí)間越短，材料越大干燥所需要的時(shí)間越長(zhǎng)。由表2-2可知，接種于添加40μM的AgNO3培養(yǎng)基中的外植體脫玻璃化率最高（42.13%），這種處理的培養(yǎng)基最有利于黑果枸杞玻璃化現(xiàn)象的解除。接種于不添加AgNO3培養(yǎng)基中的外植體脫玻璃化率最低（3.93%）。進(jìn)行方差分析后可知，5種培養(yǎng)基中外植體的脫玻璃化率沒(méi)有顯著差異。初步推測(cè)40μMAgNO3去玻璃化效果較好，今后需要擴(kuò)大樣本并提高AgNO3濃度繼續(xù)研究。圖2-2饑餓干燥后培養(yǎng)基添加AgNO3對(duì)黑果枸杞芽體去玻璃化的影響Fig.2-2TheeffectofAgNO3onthedehyperhydricitionofL.ruthenicumbudafterdried2.3討論利用成熟野外黑果枸杞的幼嫩花苞、組培瓶?jī)?nèi)無(wú)菌苗葉片和莖段為外植體，我們建立了高效可重復(fù)的再生體系。組織培養(yǎng)過(guò)程中植物材料的污染問(wèn)題是一大難題，消毒時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致消毒不徹底進(jìn)而導(dǎo)致菌類微生物大量繁殖，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)殺死外植體的組織細(xì)胞，并影響外植體的存活率。因此，選擇的合適的消毒處理方法對(duì)外植體表面進(jìn)

第三章黑果枸杞枝刺發(fā)生機(jī)理研究22第三章黑果枸杞枝刺發(fā)生機(jī)理研究3.1黑果枸杞不同發(fā)育時(shí)期枝刺的形態(tài)特征觀察黑果枸杞屬多棘刺灌木，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于其植株密被大量棘刺，嚴(yán)重影響了人工采摘的便捷、效率和品質(zhì)。黑果枸杞的棘刺始終發(fā)生在其葉腋處，不易折斷或剝離，即使強(qiáng)行折斷，斷面也很不完整。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于黑果枸杞的研究主要以對(duì)果實(shí)成分的分析和其保健功效的研究為主，對(duì)其枝刺形成機(jī)理的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡下觀察，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的黑果枸杞腋芽和枝刺進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基矗3.1.1試驗(yàn)材料選取黑果枸杞莖外植體再生的同一組培無(wú)性系作為試驗(yàn)材料。材料移栽之后進(jìn)行盆栽控水,每隔15d澆灌一次霍格蘭（Hogland）營(yíng)養(yǎng)液，分別獲得無(wú)刺（圖3-1-1-A）和有刺植株（圖3-1-1-B）（遺傳背景一致）。田間持水量在80%以上時(shí)，黑果枸杞植株整莖沒(méi)有任何肉眼可見(jiàn)刺狀結(jié)構(gòu)；田間持水量在60%以下時(shí)，黑果枸杞植株每個(gè)莖僅最上端2-3個(gè)葉腋處無(wú)刺，其余均有刺，且枝刺從上到下呈現(xiàn)逐漸延長(zhǎng)變硬的趨勢(shì)，隨著發(fā)育的進(jìn)行，上端無(wú)刺葉腋也會(huì)依次出現(xiàn)枝刺。從無(wú)刺植株取3個(gè)條枝，每條枝上取除頂芽后從上到下的6個(gè)莖節(jié)作為材料；從有刺植株取3個(gè)枝條，每條枝上取除頂芽后從上到下的6個(gè)莖節(jié)為材料。圖3-1-1黑果枸杞的無(wú)刺植株莖（A）和有刺植株莖（B）Fig.3-1-1Stemsofthornless(A)andthornyL.ruthenicum(B)3.1.2試驗(yàn)方法AB
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2893020