前 言

經(jīng)典的觀點(diǎn)認(rèn)為巨噬細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞（HSCs），HSCs 經(jīng)過(guò)一系列的分化成為單核細(xì)胞，單核細(xì)胞隨血液流動(dòng)到全身各處組織，并定居到組織中，成為組織巨噬細(xì)胞（Fig.1）[2-3]。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage colony stimulatingfactor，M-CSF，又稱作 Colony stimulating factor 1，CSF-1）在這一過(guò)程中扮演重要角色。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為 M-CSF 是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞增殖，分化，存活最為重要的細(xì)胞因子，幾乎在所有的組織中，巨噬細(xì)胞的發(fā)育均在不同程度上依賴于 M-CSF 及其受體Colony stimulating factor 1 receptor（CSF1R）所介導(dǎo)的信號(hào)通路[5]。對(duì) CSF1R 敲除小鼠的研究證明了其對(duì)組織巨噬細(xì)胞發(fā)育的重要性——CSF1R 敲除的小鼠幾乎缺失所有的巨噬細(xì)胞 [6]。 M-CSF 敲除小鼠的表型與 CSF1R 敲除小鼠的類似，但是卻并不完全相同，M-CSF敲除小鼠依然有部分組織巨噬細(xì)胞發(fā)育正常，如小膠質(zhì)細(xì)胞，朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells，LC）等[7-9]。這可能是因?yàn)槌?M-CSF 外，CSF1R還存在另一個(gè)配體——IL-34 [10]。M-CSF 結(jié)合 CSF1R 后，造成 CSF1R 二聚化，進(jìn)而使其 C 末端的 8 個(gè)絡(luò)氨酸殘基磷酸化[11]。CSF1R 磷酸化激活后，會(huì)募集一系列的接頭分子，如：PI3K 的 p85亞基, 磷脂酶 Cγ2, Grb2 等[5, 12-13]，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，從而引起增殖，分化，存活等不同的生物學(xué)效應(yīng)。其中 PI3K-Akt 和 Erk 信號(hào)通路的激活與巨噬細(xì)胞增殖及存活密切相關(guān) [14-16]。
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第一章 CKIP-1 調(diào)控巨噬細(xì)胞增殖

1.1 研究背景
GSK3β 是首個(gè)被報(bào)道的 Akt 底物。GSK3β 通常處于持續(xù)性的激活狀態(tài)，Akt的激活后會(huì)磷酸化 GSK3β，使其失活[17]。β-cateinin 是 TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子家族的共激活因子，對(duì)于促進(jìn) c-Myc，CyclinD1，CyclinD2 等與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的表達(dá)起重要作用。在巨噬細(xì)胞中，持續(xù)性激活的 GSK3β 會(huì)使 β-cateinin 磷酸化并促進(jìn)其降解，從而抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的的靶基因表達(dá)。Akt 的激活使得GSK3β 的活性受到抑制，從而釋放了 β-cateinin，促進(jìn) TCF/LEF 的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促使巨噬細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)[21]。相對(duì)于其激活過(guò)程，M-CSF 信號(hào)通路如何被關(guān)閉目前還不是很清楚。我們的研究顯示 CKIP-1 可能是 M-CSF 信號(hào)通路的一個(gè)負(fù)調(diào)控分子。CKIP-1 可通過(guò)抑制 TRAF6 介導(dǎo)的 Akt 激活，從而負(fù)調(diào)控 M-CSF 信號(hào)通路，抑制巨噬細(xì)胞增殖。

1.2 材料與方法
C57 背景的 CKIP-1 敲除小鼠為本室保存[59]，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作按照中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院規(guī)范執(zhí)行。小鼠髓系祖細(xì)胞 32D 培養(yǎng)于 RPMI1640 (Corning) + 10%胎牛血清(Hyclone) + 5% WEHI3 條件型培養(yǎng)基。穩(wěn)定表達(dá)CSF1R的32D細(xì)胞系培養(yǎng)于RPMI 1640 + 10%胎牛血清+5% WEHI3 條件型培養(yǎng)基或 RPMI 1640 (Corning) + 10%胎牛血清(Hyclone) + 20% L929條件型培養(yǎng)基。人胚腎 293T 細(xì)胞(HEK293T)培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基 (Corning) 中。小鼠單核 - 巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 培養(yǎng)于RPMI1640 + 10% 胎牛血清。PI3K 抑制劑 LY294002 購(gòu)自 Santa Cruz.Phos-tagTM AAL-107 購(gòu)自 Wako-Chem，λ 磷酸酶購(gòu)自 NEB 公司。p65，Akt，Akt T308，IKKα/β，磷酸化 IKK，IκBα 抗體購(gòu)自 CST 公司，p65 Ser276，TRAF6，CKIP-1 抗體購(gòu)自 Santa Cruz。GAPDH 抗體購(gòu)自中杉金橋。

第二章 CKIP-1 調(diào)控巨噬細(xì)胞極化.................................42

第三章 討 論..........................59

3.1  CKIP-1 的生理功能.................59

3.2  CKIP-1，Akt，GKS3β 之間的調(diào)控關(guān)系.....................60

第四章 總 結(jié).............................65

4.1  本論文獲得的主要結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn) .....................65

4.2  展望 ....................66

第三章討 論

3.1 CKIP-1 的生理功能
我們的研究顯示 CKIP-1 敲除小鼠對(duì) LPS 引起的內(nèi)毒素休克耐受（80%以上的敲除小鼠可存活，而野生型小鼠則誘發(fā)死亡）；體外培養(yǎng)的 CKIP-1-/-巨噬細(xì)胞增殖明顯快于野生型細(xì)胞，同時(shí)呈現(xiàn)向 M2 極化的趨勢(shì)；M2 極化相關(guān)分子 marker表達(dá)水平顯著上調(diào)、而 M1 極化相關(guān)分子 marker 表達(dá)水平顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)顯示 CKIP-1 在體內(nèi)條件下，是巨噬細(xì)胞增殖和極性調(diào)控的重要分子。與此同時(shí)我們組的另一部分工作正在嘗試靶向 CKIP-1 進(jìn)行骨質(zhì)酥松的治療，并取得了階段性的成果。靶向 CKIP-1 的 siRNA 經(jīng)過(guò)成骨細(xì)胞特異的核酸遞送系統(tǒng)傳遞，可以有效治療大鼠卵巢切除誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥[81]。我們的工作對(duì)于進(jìn)一步揭示 CKIP-1 的生理功能，特別是在免疫系統(tǒng)中的功能有重要意義；并可為在靶向 CKIP-1 的藥物開發(fā)時(shí)，避免可能的不良反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

3.2 CKIP-1，Akt，GKS3β 之間的調(diào)控關(guān)系
存活激酶 Akt 調(diào)控包括細(xì)胞增殖，存活，代謝，分化在內(nèi)的諸多生命活動(dòng)[17]。Akt 有著眾多的底物，如：GSK3α/β，F(xiàn)OXO1， TSC2，IKKα 等[17]。其中 GSK3β是首個(gè)被鑒定到的 Akt 底物[20]。在巨噬細(xì)胞中，Akt 和 GSK3β 分別被報(bào)道處于M-CSF 信號(hào)通路的下游，，M-CSF 刺激能造成 Akt 磷酸化激活[82]，也能造成GSK3β 磷酸化失活[21]，但是二者間是否存在必然聯(lián)系沒(méi)有報(bào)道。我們的結(jié)果顯示在 M-CSF 刺激前，加入 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制 Akt 的磷酸化激活，能有效減少 GSK3β 的磷酸化，提示 M-CSF 造成的 GSK3β 的磷酸化失活至少在一定程度上依賴 Akt 的激活。Akt 調(diào)控 GSK3β 的活性已被廣泛證實(shí)，然而作為 Akt 的底物，GSK3β 是否能反過(guò)來(lái)調(diào)控 Akt 的活性，未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究結(jié)果證實(shí) GSK3β 可通過(guò)控制一個(gè) Akt 的負(fù)調(diào)控分子——CKIP-1 的穩(wěn)定性來(lái)反饋調(diào)節(jié) Akt 的激活。CKIP-1，Akt，GKS3β 之間形成兩兩抑制的負(fù)反饋環(huán)路。雖然我們僅在 M-CSF 信號(hào)通路中證明了該反饋環(huán)路的存在，但是考慮到 Akt 參與信號(hào)通路的廣泛性，這可能是一個(gè)普適機(jī)制。
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第四章 總 結(jié)

4.1 本論文獲得的主要結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
（1） CKIP-1 是 M-CSF 信號(hào)通路的一個(gè)負(fù)調(diào)控分子。M-CSF 及其受體 CSF1R介導(dǎo)的信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞的增殖，分化，存活中發(fā)揮重要功能。相對(duì)于其激活機(jī)制，該通路的失活機(jī)制研究較少。我們的研究證實(shí) CKIP-1 可通過(guò)抑制 TRAF6 介導(dǎo)的 Akt 泛素化激活從而負(fù)調(diào)控 M-CSF 下游 PI3K-Akt信號(hào)通路。PI3K-Akt 通路對(duì)于巨噬細(xì)胞的增殖和存活至關(guān)重要，我們的結(jié)果表明 CKIP-1 缺失后巨噬細(xì)胞的增殖，存活能力增強(qiáng)，其中的機(jī)制可能是 Akt 的過(guò)度激活。（2） CKIP-1 抑制 Akt 的磷酸化依賴 TRAF6。CKIP-1 抑制 Akt 已有報(bào)道[55]，但是其具體機(jī)制仍然不清楚。CKIP-1 可通過(guò)其 PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合質(zhì)膜[106]，但是卻不能競(jìng)爭(zhēng) Akt 對(duì)質(zhì)膜的結(jié)合。然而，其 PH 結(jié)構(gòu)域?qū)τ谝种?Akt 的活性又是必需的[55]。我們的結(jié)果表明 CKIP-1 可通過(guò)抑制 Akt 的泛素連接酶 TRAF6 的活性，從而抑制其泛素化，進(jìn)而抑制其膜定位。

4.2 展望
巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程與 LPS 造成的炎癥之間的關(guān)系目前研究得還不是很清楚。我們的結(jié)果顯示 CKIP-1 敲除小鼠對(duì)于 LPS 造成的內(nèi)毒素休克耐受，CKIP-1抑制 M2 極化而促進(jìn) M1 極化。然而，我們僅在體外研究了 CKIP-1 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，CKIP-1 敲除小鼠的表型與 CKIP-1 調(diào)控巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步明確。此外，極化還參與動(dòng)脈粥樣硬化，肥胖，腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]，在這些疾病模型中進(jìn)一步研究 CKIP-1 的功能十分必要。
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參考文獻(xiàn)（略）