發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 18:40

　　 細(xì)胞衰老是指在DNA損傷、端粒酶活性丟失等內(nèi)在因素和細(xì)胞間通訊改變、體液循環(huán)因子改變等外在條件的刺激下,細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致細(xì)胞永久性退出分裂周期,無法發(fā)揮正常生理功能。而衰老細(xì)胞的累積會(huì)導(dǎo)致組織器官的衰老,進(jìn)而引發(fā)組織器官衰老問題,如機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能異常和各種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。肝臟是一個(gè)以代謝為核心功能的器官,而肝細(xì)胞是肝臟組織中最主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。膽汁合成、肝糖貯存、脂質(zhì)代謝等多種肝功能都是由肝細(xì)胞來承擔(dān)的。隨著年齡增長(zhǎng),老年肝臟肝細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了一系變化,比如肝細(xì)胞體積變大,數(shù)量減少、增殖能力降低、肝細(xì)胞核出現(xiàn)空泡,胞質(zhì)出現(xiàn)脂褐素沉積、DNA含量異常,巨核肝細(xì)胞比例升高等。然而,由于衰老肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變和功能異常,導(dǎo)致老年個(gè)體更容易發(fā)生各種肝臟疾病。比如老年個(gè)體容易出現(xiàn)肝臟脂肪性病變,老年小鼠中應(yīng)對(duì)CCl_4等化學(xué)藥物的能力下降,肝臟的炎癥水平升高,加速肝臟纖維化病癥的發(fā)生發(fā)展。由此可見,肝細(xì)胞衰老與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。因此,探尋肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的途徑是老年肝臟疾病治療的必然要求。然而由于肝臟衰老模型小鼠缺乏等各種困難,目前仍無法獲得肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的深入研究。本項(xiàng)目研究中,基于聯(lián)體共生模型,使得聯(lián)體的兩只小鼠可以共享彼此的血液微環(huán)境途徑而用來探討微環(huán)境對(duì)肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的作用。首先,我們分別建立了2月齡和24月齡小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的2月齡為Het-Y,聯(lián)體的24月齡小鼠為Het-O)、相同月齡的年輕小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的同月齡小鼠都稱為Iso-Y)和相同月齡的老年小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的老年小鼠都稱為Iso-O)3種聯(lián)體共生模型。通過流式分析結(jié)果顯示聯(lián)體小鼠間血液交換率接近50%。成功構(gòu)建聯(lián)體共生模型后,使得聯(lián)體小鼠共同生活5周,然后分別對(duì)不同組聯(lián)體小鼠肝臟肝細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特征和肝細(xì)胞功能的分析,評(píng)價(jià)年輕微環(huán)境對(duì)衰老肝細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的作用。細(xì)胞衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示,在年輕血液微環(huán)境的作用下,與Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal陽性率從38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X陽性率從53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指標(biāo)細(xì)胞周期抑制因子P53、P21和P16的表達(dá)明顯降低(p0.01);炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)水平也降低(p0.01)。其次,老年小鼠肝臟多倍體肝細(xì)胞數(shù)量增加,而多倍體肝細(xì)胞發(fā)生衰老的可能性增加。通過肝細(xì)胞比例分析發(fā)現(xiàn),在年輕微環(huán)境的作用下,與Iso-O相比,老年小鼠八倍體肝細(xì)胞比例從33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍體肝細(xì)胞比例從7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。進(jìn)一步對(duì)肝細(xì)胞數(shù)目和大小進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在年輕微環(huán)境作用下,相同視野范圍內(nèi),老年肝臟肝細(xì)胞數(shù)目從402±18個(gè)增加到617±42個(gè),細(xì)胞面積也從645.99±32.72μm~2減小至356.93±22.33μm~2。前期的研究表明隨著年齡的增加肝細(xì)胞增殖能力降低,體現(xiàn)在小鼠肝臟肝切后肝臟再生能力減弱和衰老肝細(xì)胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年輕小鼠血液的影響下,其增殖能力發(fā)生了明顯變化。原位肝組織增殖能力檢測(cè)和原代肝細(xì)胞體外短期培養(yǎng)結(jié)果都顯示,年輕微環(huán)境作用下,衰老肝細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù),增殖水平與年輕小鼠相類似。上述結(jié)果證實(shí):在年輕微環(huán)境作用下,衰老肝細(xì)胞的衰老指標(biāo)消失了,衰老肝細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生了衰老逆轉(zhuǎn),且重新獲得了類似年輕肝細(xì)胞的增殖潛能。.衰老肝細(xì)胞發(fā)生系列形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變,導(dǎo)致其對(duì)外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病在老年個(gè)體中發(fā)生機(jī)會(huì)增加。隨著年齡的增長(zhǎng),衰老肝細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙,肝臟內(nèi)脂肪累積的水平提高,老年肝臟脂肪病變的發(fā)生幾率明顯增加。在聯(lián)體共生模型中,我們發(fā)現(xiàn)老年小鼠在年輕血液微環(huán)境的調(diào)控下,老年肝臟脂肪累積程度得到明顯的緩解。肝臟脂滴原位染色結(jié)果顯示,年輕微環(huán)境的作用下,于Iso-O相比較,油紅O的陽性面積從24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼羅紅的陽性面積也降低4倍。血清學(xué)指標(biāo)也顯示老年小鼠TG、膽固醇和LDL-c水平明顯降低(p0.01),且肝損傷指標(biāo)ALT和AST的表達(dá)水平也降低(p0.01)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以得出結(jié)論:在年輕血液微環(huán)境的作用下,老年衰老肝細(xì)胞的衰老表型發(fā)生逆轉(zhuǎn),多倍體肝細(xì)胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年輕血液微環(huán)境促進(jìn)了衰老肝細(xì)胞脂肪累積水平的降低,不僅提高了肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝能力,也改善了衰老肝臟的肝功能水平。這一重要發(fā)現(xiàn),為解決衰老肝細(xì)胞增殖緩慢和老年個(gè)體肝衰竭相關(guān)疾病高頻病發(fā)而難治愈問題提供新的思路,也為理解衰老和微環(huán)境的關(guān)系、衰老肝細(xì)胞發(fā)生“返老還童”機(jī)制和延緩或有效控制肝細(xì)胞衰老提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R575
【部分圖文】：

從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的衰老逆轉(zhuǎn)已經(jīng)分別在大腦、骨骼肌、心臟、腎臟、胰腺等器官中得到運(yùn)用（圖1）。（二）聯(lián)體共生模型下細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展脫髓鞘是一種老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病原因在于老年少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）

-圖 2 聯(lián)體共生小鼠模型的構(gòu)建：聯(lián)體小鼠模型構(gòu)建及分析的技術(shù)路線；B、C：聯(lián)體 2 周時(shí)，兩只小鼠協(xié)調(diào)配合，共同；D：三種聯(lián)體模型小鼠體重的變化情況。Iso-Y 表示 2 月齡小鼠和 2 月齡小鼠聯(lián)體組合so-O 表示 24 月齡小鼠和 24 月齡小鼠聯(lián)體組合，Het 表示 2 月齡小鼠和 24 月齡小鼠聯(lián)體。

士學(xué)位論文聯(lián)體共生模型成功建立的評(píng)價(jià)體系聯(lián)體模型的有效性，我們將野生型 2 月齡 C57BL/6 小鼠與表達(dá) GFP 的 2 月齡轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行聯(lián)體。取聯(lián)體 5 周后的行流式分析。結(jié)果如圖 3 所示，聯(lián)體前，野生型小鼠中不細(xì)胞，而轉(zhuǎn)基因小鼠 99%以上細(xì)胞都帶有綠色熒光標(biāo)記。帶綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)入野生型小鼠體內(nèi)，野生型小鼠中的了轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，說明聯(lián)體兩只小鼠之間可以建立毛細(xì)體 5 周時(shí)，聯(lián)體小鼠間完成血液交換，血細(xì)胞交換率接近體模型可以用來研究年輕微環(huán)境對(duì)老年小鼠的影響。
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本文編號(hào)：2891824