發(fā)布時間：2024-07-08 20:40

　　目的:中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)是早期診斷和預測急性腎損傷(AKI)的標志物,而且調控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前針對NAGL的檢測項目并未在臨床上廣泛開展,也沒有以NGAL為靶點蛋白研發(fā)的抗腫瘤藥物。核酸適配子是一類高特異性高親和力結合靶標的單鏈DNA或RNA,在診斷和治療中廣泛應用。本研究擬通過磁珠SELEX,篩選與NGAL高特異性高親和力結合的核酸適配子,一方面用于建立可廣泛推廣、簡便低廉用于臨床診斷的酶聯(lián)適配子分析(ELAA)檢測方法;另一方面,初步探索NGAL特異性核酸適配子能否調節(jié)腫瘤細胞的惡性增殖,為抗腫瘤藥物研發(fā)提供一個新思路。方法:(1)通過磁珠SELEX篩選NGAL特異性核酸適配子,生物信息學方法對適配子進行序列同源性分析和二級結構預測,qPCR法驗證比較候選適配子及適配子對NGAL的特異性和親和力。(2)選取最優(yōu)適配子A53替換ELISA中的第二個抗體,建立ELAA檢測方法,并進行性能評價,包括特異性、線性范圍、靈敏度、精密度、準確性及臨床樣本檢測。(3)通過免疫熒光驗證A53與食管鱗癌細胞KYSE45表達的NGAL的特異性結合,克隆形成實驗和CC...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１磁珠ＳＥＬＥＸ篩選策略??

（２）磁珠ＳＥＬＥＸ篩選ＮＧＡＬ特異性適配子策略：??本研究的篩選策略是采用蛋白篩選中較為經典成熟的磁珠ＳＥＬＥＸ來篩選??靶標ＮＧＡＬ的特異性核酸適配子。具體策略如圖１：①包被ＮＧＡＬ的磁珠與??ｓｓＤＮＡ庫孵育進行ＳＥＬＥＸ篩選，并從第三輪開始在每輪篩選之前加入裸磁珠??進行....

圖２?ＥＬＡＡ檢測策略??

或多個適配子及待測靶標形成三明治夾心結構的分析模式，其原理與ＥＬ１ＳＡ相??似。本研宄用ＮＧＡＬ最優(yōu)適配子Ａ５３替代ＥＬ１ＳＡ中的第二個抗體建立了?ＥＬＡＡ??檢測方法，具體檢測策略如圖２：①將ＮＧＡＬ抗體包被于９６孔板上，用３％?ＢＳＡ??封閉；②加入ＮＧＡＬ溶液孵育洗滌；③加....

圖3，Sllt的DNA庫

第二章材料和方法第二章材料和方法??材料??單鏈ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）庫的設計和合成??用兩端各為２０ｎｔ的固定的引物互補序列，中間為３５５ｎｔ的封閉型的ｓｓＤＮＡ庫（圖３），庫容量大約１０２１，：??ＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ－Ｎ３５－ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧ－Ｎ－Ｎ?Ｎ....

圖４?ＮＧＡＬ驗證及包被結果??Ａ，考馬斯亮藍染色驗證ＮＧＡＬ純度；Ｂ，?ＢＣＡ法測定蛋白包被前后上清溶液蛋白濃度，ｔ??

干粉加入５００叫ｄｄｗ溶解后，用Ｐｉｅｒｃｅ？?ＢＣＡ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａｓｓａｙ?Ｋｉｔ測其濃度為??１．０６明／叫與說明書一致。取ｌＯ＾ＬＮＧＡＬ經１２％?ＳＤＳ?ＰＡＧＥ膠電泳后考馬斯亮藍??染色，結果如圖４Ａ，位于２５ｋＤ左右顯示明亮清晰的ＮＧＡＬ條帶，條帶大小與說??明....

本文編號：4003847