發(fā)布時間：2018-02-23 18:12

  本文關鍵詞： 樹突狀細胞 血管內(nèi)皮生長因子 內(nèi)皮樣化　出處：《鄭州大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景 樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前已知的體內(nèi)抗原呈遞功能最強的，而且是唯一能激活初始T細胞(naive T cell)的專職抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)，是啟動、調(diào)控、并維持免疫反應的中心環(huán)節(jié)。由DC激活的T細胞介導的免疫反應在機體抗腫瘤免疫中起著主導作用，DC的數(shù)量或功能的缺陷是腫瘤逃脫機體免疫監(jiān)視的重要原因，因此DC的生物功能狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的關系。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是腫瘤細胞分泌的眾多因子中的一種強力的血管生成因子，是高效的內(nèi)皮細胞有絲分裂原，可直接特異地作用于內(nèi)皮細胞，促進腫瘤血管新生。近年來研究已經(jīng)證實，VEGF可通過抑制核因子-κB(NF-κB)的活性，使DC分化成熟障礙，并可影響DC的功能及促使其凋亡。VEGF對DC的抑制降低了機體的抗腫瘤免疫功能，從而使腫瘤細胞逃脫機體的免疫監(jiān)管，促進腫瘤的生長。 最新研究報道，在高分泌VEGF的荷瘤鼠和人卵巢癌腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞群，能夠同時表達DC和內(nèi)皮細胞的標志，且體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的DC在用高表達VEGF的腫瘤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)時也可出現(xiàn)內(nèi)皮樣化改變，這些研究提示我們在高分泌VEGF的腫瘤環(huán)境中DC有可能出現(xiàn)內(nèi)皮樣化，但具體機制尚不清楚。這種內(nèi)皮樣化現(xiàn)象使DC在抗腫瘤免疫反應中不能發(fā)揮應有的抗原呈遞作用，不但使成熟有功能的DC數(shù)量進一步減少，而且內(nèi)皮樣化的DC有可能參與腫瘤血管形成，反而促進腫瘤生長。國內(nèi)外近年來關于DC的研究多集中于如何提高DC的抗原呈遞功能及制備有效的DC瘤苗等方面，而關于DC內(nèi)皮樣化現(xiàn)象及其在人類腫瘤血管形成中的作用等則有待于進一步的研究。 目的 本實驗擬對體外培養(yǎng)的人外周血單個核細胞來源的DC在VEGF誘導下能否發(fā)生內(nèi)皮樣化現(xiàn)象進行初步探討。 實驗方法 采集健康志愿者新鮮外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法獲取單個核細胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3×10~6／ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，移入二氧化碳孵育箱(5％CO_2，37℃)靜置3h，去除懸浮細胞，獲取貼壁生長的DC前體細胞，，各孔中加入1ml含rhGM-CSF(100ng／ml)和rhIL-4(5ng／ml)的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)并計數(shù)。正常對照組在培養(yǎng)過程中收集第1d、3d、7d、10d、14d的細胞采用流式細胞儀動態(tài)檢測細胞表型變化。實驗組于培養(yǎng)第3d和第7d分別加入rhVEGF(10ng／ml和100ng／ml)進行誘導培養(yǎng)，并于隔天半量換液時半量補充因子量。分別用VEGF誘導培養(yǎng)7d后收集細胞，經(jīng)熒光素標記抗體后，采用流式細胞技術檢測DC特異性標志CD1a和內(nèi)皮細胞特異性表面分子CD34、CD31的表達情況，并分別用免疫熒光法及免疫細胞化學法檢測內(nèi)皮細胞特異性標志vWF的表達情況。 采用統(tǒng)計學軟件包SPSS12.0對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用(?)±s表示，各組之間的比較采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較用q檢驗，顯著性檢驗水準為α=0.05。 結(jié)果 1．正常對照組細胞在培養(yǎng)的第5d開始出現(xiàn)突起，第7d時突起更加明顯，并且大量突起交織，之后細胞逐漸增大變圓，出現(xiàn)懸浮趨勢。VEGF誘導的各實驗組細胞生長過程明顯落后于正常對照組，而且細胞密度較低。 2．正常對照組細胞在培養(yǎng)初期出現(xiàn)少量CD34、CD31表達，隨培養(yǎng)時間的延長，其表達量逐漸降低，而DC的特異性標志CD1a的表達量逐漸升高。用VEGF誘導7d后，各實驗組細胞CD1a的表達受抑制。各實驗組細胞CD1a與內(nèi)皮細胞表面標志CD34、CD31的共表達率均高于相應正常對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義，并且其共表達情況存在如下趨勢：3d大劑量組＞7d大劑量組＞3d小劑量組和7d小劑量組。 3．用VEGF誘導的實驗組中存在胞漿著色的陽性細胞，提示有vWF的表達，并且各實驗組之間的表達趨勢和上述流式細胞儀檢測到的共表達趨勢相似，而且積分光密度(IOD)和陽性區(qū)面積百分比(Aera％)均高于其相應正常對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1．在體外培養(yǎng)過程中，VEGF能抑制或減緩DC的生長過程，并使DC的特異性表面標志CD1a表達減少。 2．在VEGF誘導下，DC可以表達一些內(nèi)皮細胞特異性標志(CD31、CD34、vWF)，出現(xiàn)內(nèi)皮樣化傾向，而且大劑量誘導比小劑量誘導更容易出現(xiàn)內(nèi)皮樣化傾向、早期誘導比晚期誘導更容易出現(xiàn)內(nèi)皮樣化傾向。
[Abstract]:Research background
Dendritic cells (dendritic cell DC) is currently the most powerful antigen-presenting body, and is the only way to activate naive T cells (naive T cell) professional antigen-presenting cells (antigen, presenting, cell, APC) is the start, control, and maintain the central link of the immune response plays a dominant role in T. Cell mediated immune response activated by DC in anti tumor immune, the number of defects or function of DC is an important cause of tumor escape from immune surveillance, so the occurrence and development of tumor and biological function of DC has an important relationship.
Vascular endothelial growth factor (vascular endothelial, factor growth, VEGF) is a potent angiogenic factor secreted by tumor cells in many factors, is an effective mitogen of endothelial cells, can direct specific effect on endothelial cells, promote tumor angiogenesis. Recent studies have confirmed that VEGF can inhibit nuclear factor kappa B (NF- K B) activity, the DC differentiation and maturation disorder, and can inhibit the effect of the function of DC and induce the apoptosis of DC.VEGF reduced the anti tumor immune function, so that the tumor cells escape the immune regulation, promoting tumor growth.
The latest research reports, the secretion of VEGF murine and human ovarian cancer tissues from the discovery of a new group of cells, can express the markers of DC and endothelial cells, and cultured mouse bone marrow-derived DC with high expression of VEGF tumor conditioned medium also can appear when the change of endothelial like, these studies suggest that we in the secretion of VEGF in tumor environment DC likely endothelialisation, but the mechanism is still unclear. The endothelialisation phenomenon that DC can not play its due role in antigen presentation in the anti-tumor immune response, not only makes the mature quantity function of DC decreased further, and endothelial like the DC may be involved in tumor angiogenesis, but to promote tumor growth. DC tumor vaccine and other aspects of domestic and foreign research in recent years on the DC is focused on how to improve the antigen-presenting function of DC and the effective preparation, and to DC endothelia and its role in human tumor angiogenesis need to be further studied.
objective
This experiment is intended to investigate the possibility of endothelia in human peripheral blood mononuclear cells derived from human peripheral blood mononuclear cells (DC) induced by VEGF in vitro.
Experimental method
Healthy volunteers collected fresh peripheral blood mononuclear cells, obtained by Ficoll density gradient centrifugation method, using RPMI 1640 complete medium cell concentration was adjusted to 3 * 10~6 / ml were seeded in 24 well plates, each hole 1ml, into carbon dioxide incubator (5%CO_2,37 C) static 3h, remove the suspension cells. To obtain adherent DC precursor cells, into the holes in the 1ml containing rhGM-CSF (100ng / ml) and rhIL-4 (5ng / ml) RPMI 1640 were cultured. During the culture cells were observed and counted. The normal control group were collected at 1D, in the training process of 3D, 7d, 10d, 14d the cells by flow cytometry dynamic changes in phenotype. In the experimental group training section 3D and 7d were added to rhVEGF (10NG / ml and 100ng / ml) were cultured, and the next day when the quantity of liquid exchange half half amount of complement factor respectively. Induced by VEGF after cultured 7d cells were collected by fluorescein standard After antibody, the expression of DC specific marker CD1a and endothelial specific surface molecule CD34 and CD31 were detected by flow cytometry. The expression of vWF was detected by immunofluorescence and immunocytochemistry.
Statistical software package SPSS12.0 was used to analyze the results. The results were expressed by (+) s. The comparison between the groups was performed by one-way ANOVA (ONE-WAY ANOVA). Q comparison was used in the comparison between 22 groups, with a significant test level of alpha =0.05..
Result
1. normal control group cells began to appear in the processes of 5D culture, the 7d projection is more obvious, and a lot of protrusions intertwined, after cells gradually became round, the growth process was significantly lower than that in normal control group in each experimental group cell suspension trend induced by.VEGF, and the cell density is low.
2. normal control group cells occurred at the beginning of a small amount of CD34, the expression of CD31, with prolonged incubation time, the expression decreased gradually, while the DC specific marker CD1a expression gradually increased by VEGF. After 7d induction, the expression of each experimental group CD1a cells was inhibited. The experimental group of CD1a and endothelial cells cell surface marker CD34 was better than that of the normal control group co expression of CD31, and the difference was statistically significant, and the co expression has the following trends: high dose group 3D > 7d > 3D in high dose group and small dose group 7d small dose group.
Positive cells existed in cytoplasm of experimental group induced by VEGF in 3., suggesting that the expression of vWF, and the expression trend between the experimental group and the flow cytometry detected the co expression of a similar trend, and the integral optical density (IOD) and the percentage of positive area (Aera%) were higher than those of the normal the control group, and the difference was statistically significant.
Conclusion:
1. in the process of culture in vitro, VEGF can inhibit or slow down the growth of DC, and reduce the expression of the specific surface of DC on the expression of CD1a.
2., under the guidance of VEGF, DC can express some endothelial specific markers (CD31, CD34, vWF), showing endothelia like tendency. Moreover, high-dose induction is more prone to endothelia like tendency than low dose induction. Early induction is more prone to endothelial like tilting than late induction.

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：1527109