發(fā)布時(shí)間：2018-02-24 03:13

  本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 趨化因子受體 脾細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 近年來(lái)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究初步顯示其具有促進(jìn)骨髓移植后供者細(xì)胞植入的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床統(tǒng)計(jì)都提示了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的共同輸注可以提高造血干細(xì)胞的植入，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)植入的機(jī)制尚不清楚。有關(guān)異基因造血干細(xì)胞移植后干細(xì)胞的歸巢、增殖、分化相關(guān)研究中，，其中一個(gè)研究熱點(diǎn)是趨化因子及其受體的相互作用。趨化因子受體是一類表達(dá)于不同類型細(xì)胞上的含有7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體超家族，通過(guò)與趨化因子作用參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡、組織分布等。它可以激活磷脂酶、脂類激酶、蛋白激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活JAK／STAT途徑，引發(fā)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)通路�，F(xiàn)有的研究已經(jīng)顯示趨化因子及其受體對(duì)造血干細(xì)胞的游走和歸巢有著重要作用：淋巴細(xì)胞在歸巢的過(guò)程中通過(guò)細(xì)胞膜表面的CD62L粘附于高內(nèi)皮微靜脈(HEV)，隨后淋巴細(xì)胞表面的CCR7與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的刺激淋巴組織趨化因子(SLC)相結(jié)合，CCR7-SLC的相互作用促進(jìn)了T細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)；在B細(xì)胞方面，BLC／CXCR5可以引導(dǎo)成熟B淋巴細(xì)胞游走和歸巢，并對(duì)成熟B細(xì)胞在次級(jí)淋巴細(xì)胞中的B細(xì)胞區(qū)的發(fā)育有著重要作用。趨化因子及其受體除了可以促進(jìn)造血細(xì)胞歸巢，它們對(duì)造血細(xì)胞的增殖和分化也有重要作用：SDF-1／CXCR4參與了造血細(xì)胞的增殖、分化、遷移等活動(dòng)，且早期B淋巴干細(xì)胞發(fā)育也需要CXCR4的表達(dá)；SDF-1、ELC、SLC、TECK、MDC等趨化因子在T細(xì)胞胸腺中分化的不同階段發(fā)揮著不同的趨化作用，且SLC和ELC共同肩負(fù)著T細(xì)胞在二級(jí)淋巴器官內(nèi)的分布。他們也在DC與T細(xì)胞的相互作用、T細(xì)胞的激活、極化、效應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用�；�于趨化因子及其受體對(duì)造血細(xì)胞歸巢及增殖分化方面的作用，為了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞植入的相關(guān)機(jī)制，我們研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索MSC的免疫調(diào)控機(jī)制。 方法 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究：無(wú)菌條件下采集健康志愿者骨髓液及C57BL／6小鼠股、脛骨骨髓，分別以2.0×10~5的密度接種培養(yǎng)，24～48小時(shí)后棄去懸浮細(xì)胞，以后每3天換1次液。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80～90％融合時(shí)，按1：4～5的比例傳代培養(yǎng)。分別取第1代，第3代和第5代繪制生長(zhǎng)曲線。第4～5代各取2×10~5個(gè)細(xì)胞，采用雙色標(biāo)記法標(biāo)記CD34、CD44、CD166、HLA-DR單抗。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PHA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖后趨化因子受體表達(dá)的影響：C57BL／6小鼠脾細(xì)胞以1×10~6／孔的密度接種于24孔板，加入植物血凝素，培養(yǎng)72小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分三組：A組按10％比例加入MSC；B組按1％比例加入MSC；對(duì)照組不加MSC。3天后收集懸浮的脾細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 3、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓細(xì)胞聯(lián)合輸入動(dòng)物模型的建立：無(wú)菌條件下取C57BL／6小鼠骨髓，骨髓移植第0天BALB／c小鼠經(jīng)~(60)Co全身照射(TBI9.0Gy，0.5Gy／min)，4小時(shí)內(nèi)接受骨髓移植。實(shí)驗(yàn)分三組：A組BMC4×10~7及MSC 4×10~5；B組BMC4×10~7及生理鹽水；C組生理鹽水。觀察指標(biāo)：1、小鼠的生存時(shí)間及一般情況；2、小鼠的體重變化。 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)或百分率(％)表示。采用SPSS 12.0 for Windows軟件進(jìn)行單因素方差分析，多組間進(jìn)行LSD-test。 結(jié)果： 1、臨床獲取的健康人骨髓液經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后，可獲得乳白色的細(xì)胞層。該層細(xì)胞及C57BL／6小鼠骨髓單細(xì)胞懸液各自接種培養(yǎng)24～48小時(shí)后，棄去未貼壁細(xì)胞，可見貼壁生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞散在分布，形態(tài)均呈梭形、扁平形和小圓形，約3～4天后貼壁細(xì)胞迅速增殖，6天后開始出現(xiàn)較大的克隆，10天左右細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％以上融合。細(xì)胞漸趨向均一的長(zhǎng)梭形，漩渦狀分布。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80～90％融合時(shí)傳代培養(yǎng)，約7～10天傳代一次，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較原代細(xì)胞快，約7天左右細(xì)胞再次融合達(dá)80～90％。細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向?yàn)槁菪隣钆帕械拈L(zhǎng)梭形細(xì)胞，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)。連續(xù)傳代約10代后細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，塊狀死亡脫落后并片狀蔓延。C57BL／6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)上較健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞小，細(xì)胞界限更清晰。從對(duì)P1、P2、P3代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)三代細(xì)胞具有以下共同特征：傳代培養(yǎng)的潛伏期為24～36小時(shí)，對(duì)數(shù)增殖期約為2～3天，對(duì)數(shù)增殖期后第5天進(jìn)入平臺(tái)期。小鼠及健康人來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖規(guī)律大致相似。流式細(xì)胞儀檢測(cè)生長(zhǎng)良好的第3代hMSC顯示CD44、CD166表達(dá)陽(yáng)性，CD34、HLA-DR表達(dá)為陰性。 2、脾細(xì)胞經(jīng)PHA刺激及與MSC共培養(yǎng)后趨化因子受體表達(dá)變化：脾細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后均可檢測(cè)到CCR5、CCR7及CXCR3三種趨化因子受體的表達(dá)，在MSC共培養(yǎng)體系中，趨化因子受體表達(dá)受MSC的影響且表達(dá)水平的變化與MSC濃度有關(guān)(表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在與CD3脾細(xì)胞呈一定的細(xì)胞比例共培養(yǎng)時(shí)能上調(diào)T細(xì)胞趨化因子受體CCR5、CCR7、CXCR3的表達(dá)，對(duì)前二者，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著MSC濃度的增高，趨化因子受體的表達(dá)越高。 3、脾細(xì)胞經(jīng)PHA刺激及與MSC共培養(yǎng)后各細(xì)胞亞群趨化因子受體表達(dá)變化：CXCR3陽(yáng)性細(xì)胞中僅CD3~+CD8~+細(xì)胞群可以觀察到趨化因子受體隨著MSC濃度增高而表達(dá)增高，CD3~+CD8~-細(xì)胞群在各濃度趨化因子受體表達(dá)無(wú)顯著差異；CCR5陽(yáng)性細(xì)胞主要在CD3~+CD8~-細(xì)胞群中可以觀察到趨化因子受體的表達(dá)隨著MSC濃度增高而增強(qiáng)，CD3~+CD8~+細(xì)胞群僅在MSC濃度為10％時(shí)較無(wú)MSC時(shí)表達(dá)增高；CCR7陽(yáng)性細(xì)胞則在CD3~+CD8~-和CD3~+CD8~+細(xì)胞均可觀察到趨化因子受體的表達(dá)隨著MSC濃度增高而增強(qiáng)。 4、+5天C組小鼠死亡66.7％，其余小鼠生存均超過(guò)30天。各組小鼠均出現(xiàn)毛發(fā)稀少、發(fā)抖等情況�？紤]為照射后出現(xiàn)的非特異性表現(xiàn)。體重變化圖提示A組小鼠體重緩慢上升，B組小鼠體重上升后有所下降，C組小鼠體重緩慢下降。 結(jié)論 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道相似，對(duì)本試驗(yàn)室條件下細(xì)胞生長(zhǎng)周期及生長(zhǎng)條件的掌握對(duì)下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)生長(zhǎng)良好的第3代健康人MSC顯示CD44、CD166表達(dá)陽(yáng)性，CD34、HLA-DR表達(dá)為陰性。符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。 3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在與脾細(xì)胞呈一定的細(xì)胞比例共培養(yǎng)時(shí)能上調(diào)T細(xì)胞趨化因子受體CCR5、CCR7、CXCR3的表達(dá)，對(duì)前二者隨著MSC細(xì)胞濃度提高，趨化因子受體表達(dá)更強(qiáng)。上述三種趨化因子受體在CD3~+CD8~-和CD3~+CD8~+兩大亞群中表達(dá)上調(diào)的分布不同。研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)能提高T細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)，這可能有利于骨髓移植后促使淋巴細(xì)胞在趨化因子的作用下移行和歸巢到骨髓及淋巴器官，從而有利于促進(jìn)造血細(xì)胞植入。這可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞植入的機(jī)制之一。 4、骨髓細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞混合輸注的動(dòng)物模型基本確立骨髓細(xì)胞輸注的數(shù)量級(jí)，間充質(zhì)干細(xì)胞輸注后并未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；經(jīng)過(guò)照射的BALB／c小鼠可以出現(xiàn)非特異性照射病，表現(xiàn)為毛發(fā)聳起，發(fā)抖等；該動(dòng)物模型為進(jìn)一步行骨髓細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同輸注的后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 從玉文,毛秉智,羅慶良,董波,陳惠鵬;重組人粒細(xì)胞集落刺激因子治療急性放射病的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;1996年02期

2 許紅波,李春富,吳建春,楊明,馮曉勤;異種骨髓移植移植物抗宿主反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2003年02期

本文編號(hào)：1528660