E型肉毒神經(jīng)毒素重組Hc-C亞單位疫苗免疫原性研究
發(fā)布時間:2020-12-10 00:33
目的利用大腸桿菌高效表達并純化E型肉毒神經(jīng)毒素(BoNT/E)受體結(jié)合區(qū)Hc的亞結(jié)構(gòu)域EHc-C蛋白,并進行免疫原性研究。方法利用PCR技術(shù)擴增出EHc-C基因,克隆于載體pTIG-Trx-His-tag中得到重組質(zhì)粒pTIG-Trx-EHc-C,轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達后,超聲破碎菌體,收集上清,經(jīng)鎳柱親和純化獲得重組抗原EHc-C蛋白,通過SDS-PAGE和Western印跡檢測純化效果,之后免疫BALB/c小鼠,評價其免疫原性。結(jié)果通過原核表達純化獲得了純度>90%的重組抗原EHc-C蛋白,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了特異性抗體反應,10μg劑量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104LD50E型肉毒毒素攻擊,血清中和抗體效價可達1.00 U/ml。結(jié)論獲得的重組EHc-C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻擊,產(chǎn)生強烈保護作用,可作為亞單位候選疫苗預防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗體的功能表位。
【文章來源】:軍事醫(yī)學. 2019年05期 第346-351頁 北大核心
【文章頁數(shù)】:6 頁
【部分圖文】:
pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鑒定圖
軍事醫(yī)學2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.未加IPTG誘導對照;2.包涵體;3.誘導表達破菌上清;4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.誘導表達破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應,第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強,陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應;此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應更傾向于Th2
?2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.未加IPTG誘導對照;2.包涵體;3.誘導表達破菌上清;4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.誘導表達破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應,第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強,陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應;此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應更傾向于Th2型免?
本文編號:2907750
【文章來源】:軍事醫(yī)學. 2019年05期 第346-351頁 北大核心
【文章頁數(shù)】:6 頁
【部分圖文】:
pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鑒定圖
軍事醫(yī)學2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.未加IPTG誘導對照;2.包涵體;3.誘導表達破菌上清;4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.誘導表達破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應,第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強,陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應;此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應更傾向于Th2
?2019年5月第43卷第5期MilMedSci,Vol43,No5,May,2019柱對重組EHcC蛋白進行純化,經(jīng)SDSPAGE檢測純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小,且咪唑濃度為100mmol/L時純度達到了電泳級。Western印跡證實該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合,具有E型毒素的抗原性(圖3)。圖2EHc-C誘導表達的SDS-PAGE檢測M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.未加IPTG誘導對照;2.包涵體;3.誘導表達破菌上清;4.誘導表達全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物;1.誘導表達破菌上清;2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白;3.穿過液;4.脫鹽蛋白;5,6.Western印跡檢測表達純化產(chǎn)物:5.一抗為抗EHc抗體;6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定采用ELISA方法檢測免疫后小鼠血清中的體液免疫反應,第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強,陰性對照組的抗體水平無變化(圖4),表明此重組抗原免疫原性良好;抗體滴度的結(jié)果表明,EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200,最高滴度為1∶6400;第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200,最高滴度為1∶409600(圖5),相對于第2次免疫的抗體滴度,第3次有明顯的增強,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應;此外,還對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進行了測定,抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1(圖6),即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應更傾向于Th2型免?
本文編號:2907750
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