發(fā)布時間：2018-03-10 11:38

  本文選題：精子RNA　切入點：高通量測序　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在傳統(tǒng)的觀念中,精子的主要作用是給后代提供父源基因組和之后激活胚胎的受精發(fā)育,卵母細胞負責(zé)調(diào)控胚胎發(fā)育,這種片面的理解就導(dǎo)致長時期以來人們把目光過多的放在卵母細胞上,而忽略了對精子的認識。在受精過程中,蛋白質(zhì)、小的非編碼RNA、mRNA等都會被帶入卵母細胞中,進而對雌雄原核形成、卵裂球分裂時空的順序、合子基因轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育乃至后代表型等都具有重要的意義,也就意味著精子參與了早期胚胎發(fā)育和介導(dǎo)核進行重編程等一系列過程。因此對受精過程中被帶入卵母細胞的成分進行細致的研究有助于解開發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵性難題。本研究的主要目的是構(gòu)建精子,卵母細胞和體細胞的小RNA高通量表達文庫,篩選出精子差異性表達的miRNA(microRNA)�；�于此,探索出一套高效提取高質(zhì)量精子RNA的方法是研究其內(nèi)容物和構(gòu)建小RNA表達文庫的基礎(chǔ)。精子是高密度的濃縮體,攜帶RNA量極少,因此從精子內(nèi)容物中提取RNA難度頗大。此外,由于睪丸中成熟精子量少、鮮精成本高和凍精活力低,我們往往需要額外精細的提取步驟和RNA質(zhì)控從而保證提取的RNA的濃度和完整性,并且通過RT-PCR檢測提取出的RNA質(zhì)量。采用Solexa高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)進行篩選牛精源性高表達的miRNA并且將其外源模擬物注入卵母細胞,或以誘導(dǎo)表達的方式賦予體細胞精子水平,探索精源性miRNA對早期胚胎發(fā)育水平的影響。(1)創(chuàng)新合理的從牛附睪尾部采精并進一步獲能純化,之后通過不同方法與實驗條件摸索出提取牛精子RNA最優(yōu)化的方法,通過qRT-PCR對提取的精子RNA進行了特征性基因及完整性檢測。實驗從附睪中分離精子并通過上游獲能收集純化成熟的精子,并用加熱到60℃的TRIzol裂解液提取精子RNA,實驗表明可保證較好的純度和完整度;(2)通過Illumina高通量測序建立成熟精子的小RNA文庫,同時對相應(yīng)的靶基因和通路進行了預(yù)測和分析。在miRBase2.0中將18-26 nt的Unique序列比對到相應(yīng)特異性的前體上,共檢測到951個已知的miRNA和8個新的高表達候選miRNA。精源性的miRNA數(shù)據(jù)庫對胚胎發(fā)育、表觀遺傳學(xué)功能和分子機制分析提供了基本但十分重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);(3)從三個樣本高通量測序文庫(牛皮膚成纖維細胞、MII期卵母細胞和成熟獲能后精子)中篩選得到了精子特異性表達的miRNA作為初步候選,通過實時熒光PCR驗證排除測序?qū)嶒灲Y(jié)果的假陽性,進一步對所獲得的miRNA數(shù)據(jù)進行分類注釋和表達模式分析,GO富集性分析和KEGG通路分析。以精子所攜載的miR-202為研究對象,通過外源顯微注射miRNA模擬物進入卵母細胞的形式,模擬正常受精中精子外源帶入miR-202的表達水平,通過卵裂率和乙�；�水平檢測,發(fā)現(xiàn)它可以提高胚胎發(fā)育和核的重編程能力。(4)構(gòu)建miR-449b的Tet-On 3G誘導(dǎo)表達載體,實驗組為經(jīng)過篩選的克隆陽性細胞經(jīng)強力霉素(Doxycycline,Dox)誘導(dǎo)后作為供體細胞進行體細胞核移植,不經(jīng)過Dox誘導(dǎo)的為對照組。結(jié)果表明賦予供核體細胞以精子樣的miR-449b水平,顯著提高牛體細胞核移植,胚胎的體外發(fā)育和核的重編程能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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6 印惠s，

本文編號：1593185