發(fā)布時(shí)間：2018-03-10 11:38

  本文選題：精子RNA　切入點(diǎn)：高通量測(cè)序　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在傳統(tǒng)的觀念中,精子的主要作用是給后代提供父源基因組和之后激活胚胎的受精發(fā)育,卵母細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控胚胎發(fā)育,這種片面的理解就導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)期以來(lái)人們把目光過(guò)多的放在卵母細(xì)胞上,而忽略了對(duì)精子的認(rèn)識(shí)。在受精過(guò)程中,蛋白質(zhì)、小的非編碼RNA、mRNA等都會(huì)被帶入卵母細(xì)胞中,進(jìn)而對(duì)雌雄原核形成、卵裂球分裂時(shí)空的順序、合子基因轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育乃至后代表型等都具有重要的意義,也就意味著精子參與了早期胚胎發(fā)育和介導(dǎo)核進(jìn)行重編程等一系列過(guò)程。因此對(duì)受精過(guò)程中被帶入卵母細(xì)胞的成分進(jìn)行細(xì)致的研究有助于解開發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵性難題。本研究的主要目的是構(gòu)建精子,卵母細(xì)胞和體細(xì)胞的小RNA高通量表達(dá)文庫(kù),篩選出精子差異性表達(dá)的miRNA(microRNA)�；�于此,探索出一套高效提取高質(zhì)量精子RNA的方法是研究其內(nèi)容物和構(gòu)建小RNA表達(dá)文庫(kù)的基礎(chǔ)。精子是高密度的濃縮體,攜帶RNA量極少,因此從精子內(nèi)容物中提取RNA難度頗大。此外,由于睪丸中成熟精子量少、鮮精成本高和凍精活力低,我們往往需要額外精細(xì)的提取步驟和RNA質(zhì)控從而保證提取的RNA的濃度和完整性,并且通過(guò)RT-PCR檢測(cè)提取出的RNA質(zhì)量。采用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行篩選牛精源性高表達(dá)的miRNA并且將其外源模擬物注入卵母細(xì)胞,或以誘導(dǎo)表達(dá)的方式賦予體細(xì)胞精子水平,探索精源性miRNA對(duì)早期胚胎發(fā)育水平的影響。(1)創(chuàng)新合理的從牛附睪尾部采精并進(jìn)一步獲能純化,之后通過(guò)不同方法與實(shí)驗(yàn)條件摸索出提取牛精子RNA最優(yōu)化的方法,通過(guò)qRT-PCR對(duì)提取的精子RNA進(jìn)行了特征性基因及完整性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)從附睪中分離精子并通過(guò)上游獲能收集純化成熟的精子,并用加熱到60℃的TRIzol裂解液提取精子RNA,實(shí)驗(yàn)表明可保證較好的純度和完整度;(2)通過(guò)Illumina高通量測(cè)序建立成熟精子的小RNA文庫(kù),同時(shí)對(duì)相應(yīng)的靶基因和通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。在miRBase2.0中將18-26 nt的Unique序列比對(duì)到相應(yīng)特異性的前體上,共檢測(cè)到951個(gè)已知的miRNA和8個(gè)新的高表達(dá)候選miRNA。精源性的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胚胎發(fā)育、表觀遺傳學(xué)功能和分子機(jī)制分析提供了基本但十分重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);(3)從三個(gè)樣本高通量測(cè)序文庫(kù)(牛皮膚成纖維細(xì)胞、MII期卵母細(xì)胞和成熟獲能后精子)中篩選得到了精子特異性表達(dá)的miRNA作為初步候選,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證排除測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性,進(jìn)一步對(duì)所獲得的miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分類注釋和表達(dá)模式分析,GO富集性分析和KEGG通路分析。以精子所攜載的miR-202為研究對(duì)象,通過(guò)外源顯微注射miRNA模擬物進(jìn)入卵母細(xì)胞的形式,模擬正常受精中精子外源帶入miR-202的表達(dá)水平,通過(guò)卵裂率和乙�；�水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)它可以提高胚胎發(fā)育和核的重編程能力。(4)構(gòu)建miR-449b的Tet-On 3G誘導(dǎo)表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)過(guò)篩選的克隆陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)強(qiáng)力霉素(Doxycycline,Dox)誘導(dǎo)后作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植,不經(jīng)過(guò)Dox誘導(dǎo)的為對(duì)照組。結(jié)果表明賦予供核體細(xì)胞以精子樣的miR-449b水平,顯著提高牛體細(xì)胞核移植,胚胎的體外發(fā)育和核的重編程能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S814

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張學(xué)明;法美聯(lián)手從胚胎干細(xì)胞首次培育出生殖細(xì)胞[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年04期

2 ;胚胎干細(xì)胞與胚胎生殖細(xì)胞[J];生物技術(shù)通報(bào);2005年02期

3 ;歐盟啟動(dòng)胚胎干細(xì)胞分化機(jī)理的大型研究項(xiàng)目[J];中國(guó)家禽;2012年06期

4 何誠(chéng),雷蕾,夏國(guó)良;哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧雜志;2001年06期

5 滕勇,經(jīng)榮斌;畜禽胚胎干細(xì)胞的研究及其應(yīng)用價(jià)值[J];動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué);2002年12期

6 金立方,王新莊;影響胚胎干細(xì)胞分離克隆的因素分析[J];黃牛雜志;2003年05期

7 李曉梅,曾養(yǎng)志;豬胚胎干細(xì)胞的分離克隆[J];當(dāng)代畜牧;2003年11期

8 張東,薛曉先;胚胎干細(xì)胞的研究概況[J];內(nèi)蒙古畜牧科學(xué);2003年04期

9 竇忠英,徐小明,華進(jìn)聯(lián);牛胚胎干細(xì)胞建系研究進(jìn)展及存在問(wèn)題[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2003年05期

10 柯麗白;胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展與前景[J];草食家畜;2004年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 付強(qiáng);王珂;王常勇;;心肌方向分化和富集對(duì)胚胎干細(xì)胞在心肌缺血部位移植后致腫瘤能力的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

2 趙惠萍;王綺如;;骨髓內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的造血分化[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)新世紀(jì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2002年

3 姚玲玲;朱依純;;胚胎干細(xì)胞分化潛能研究進(jìn)展[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)論文匯編2004年第二期[C];2004年

4 黃華容;徐超;趙小立;陳良標(biāo);張銘;;誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成平滑肌的研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

5 王樹玉;張軍;任國(guó)慶;;胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展[A];第五屆全國(guó)優(yōu)生科學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2000年

6 印惠s，

本文編號(hào)：1593185