發(fā)布時(shí)間：2020-11-19 00:34

　　 為探討白藜蘆醇對(duì)蛋雞肝細(xì)胞脂肪變性PPARα信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理,通過(guò)改良原位二步灌流法獲得了高活性蛋雞原代肝細(xì)胞,依據(jù)人體非酒精性脂肪肝等體外模型,使用混合脂肪酸(油酸:棕櫚酸為2:1)處理肝細(xì)胞建立脂肪變性模型,分為四組,分別為Control組(正常培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞)、FA組(Control組+1.0 mM脂肪酸)、FA+Res組(FA組+80μM白藜蘆醇)、Con+Res組(Control組+80μM白藜蘆醇)。然后測(cè)定細(xì)胞活性,抗氧化指標(biāo)(SOD、MDA),脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)(TG、TC、HDL-ch、LDL-ch),凋亡基因(Bcl-2、BAX、Caspaes-3)以及PPARα信號(hào)通路相關(guān)基因(ADFP、FABP1、FABP3、PPARα、Srebp-1c、Apo-A1、Apo-B100、SCD-1)mRNA表達(dá)量,此外,還利用慢病毒構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體從而使肝細(xì)胞中PPARα基因過(guò)表達(dá),結(jié)果如下:(1)通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)及脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè),確定當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mM脂肪酸48h時(shí),為最佳造模條件,在添加0.5-1.2mM的脂肪酸時(shí),相比于Control組,TG含量均極顯著上升(P0.01)。(2)與Control組相比,FA組SOD活性極顯著下降,且MDA含量顯著升高(P0.05),而FA+Res組情況明顯得到改善;與Control組相比,FA組TG和TC含量極顯著升高(P0.01),而與FA組比較,FA+Res組TG和TC含量極顯著下降(P0.01)。(3)與Control組相比,FA組BAX、Caspase-3顯著上升(P0.05),而B(niǎo)cl-2mRNA含量顯著下降(P0.05)。與FA組相比,FA+Res組Caspase-3 mRNA含量顯著下降(P0.05)。(4)與Control組相比,FA組ADFP、FABP1、FABP3、Srebp-1c、Apo-A1 mRNA含量極顯著上升(P0.01);PPARα、Apo-B100、SCD-1 mRNA含量顯著下降(P0.05或P0.01),與FA組相比,FA+Res組Srebp-1c、FABP1、FABP3、ADFP均極顯著下降(P0.01)。(5)PPARα慢病毒過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)染效果:MOI值為125及以下時(shí)顯示無(wú)熒光,而MOI值達(dá)到150及以上時(shí)出現(xiàn)綠色熒光,但是原代肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率極低,沒(méi)有達(dá)到預(yù)期值;選擇傳代PK-15細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn),在MOI達(dá)到5時(shí),轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。綜上所述:本實(shí)驗(yàn)成功建立了由1mM脂肪酸(棕櫚酸:油酸=2:1)誘導(dǎo)的蛋雞原代肝細(xì)胞脂肪變性模型。白藜蘆醇能夠通過(guò)調(diào)控蛋雞肝細(xì)胞脂肪變性PPARα信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)改善脂質(zhì)沉積水平。
【學(xué)位單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

擴(kuò)增電泳圖，M 為 mark，1 為退火溫度 60.8 ℃結(jié)果，2 為退火溫度 59.7 ℃退火溫度 58.3 ℃結(jié)果，4 為退火溫度 57.2 ℃結(jié)果CR amplified electrophoresis map, M is mark, 1 is the annealing temperature of ealing temperature of 59.7 ℃, 3 is the annealing temperature of 58.3 ℃, 4 is thetemperature of 57.2 ℃PCR 拼接 1：所有的 Oligo 進(jìn)行 PCR 拼接，在目的位置切割膠回收膠回收試劑盒回收純化（按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）。PCR 拼接 2：以割膠純化產(chǎn)物為模板，目的序列最兩端的 Oligo 為CR 拼接，在目的條帶位置進(jìn)行割膠回收純化，OD 測(cè)定質(zhì)檢和定雙酶切。表 2-3 酶切體系Table 2-3 Enzyme digestion system溶液組分 體積10×內(nèi)切酶 Buffer 5.0 μLPCR 純化產(chǎn)物 1 μg

圖 1-2 慢病毒包裝流程Fig 1-2 Lentivirus packaging process慢病毒載體和包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒縮，然后用熒光法測(cè)定其滴度。取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 293T 細(xì)胞，用胰酶（0.2 %）基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每個(gè) 10 cm 的培養(yǎng)皿 6×培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；第二天確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)。并在轉(zhuǎn)染前移去培養(yǎng)液，換 5 ml Opti-MEM：取 9 μg Packaging Mix 和 3 μg 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒加入 1.5 ml Opti-）中，輕輕混勻；Lipo 稀釋：取 36 μl lipofectamine 2000 加入另外的 1.5 ml Opti-ME室溫放置 5 min；輕輕混合質(zhì)粒溶液（1.3）和 lipofectamine 2000 稀釋液（1.4），置室轉(zhuǎn)染：將 3 ml 質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物（1.5）小心地加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中孵育 6 個(gè)小時(shí)后，更換完全培養(yǎng)液 DM

18圖 2-1 蛋雞原代肝細(xì)胞不同倍數(shù)及時(shí)間的形態(tài)學(xué)觀察A：100 （0 h）；B：200 （0 h）；C：100 （3.5 h）；D：200 （3.5 h）；E：100 （24 h）；F：200 （24 h）Fig 2-1 Morphological observation for primary hepatocytes of laying hens in different magnification andtime.A：100 (0 h)；B：200 (0 h)；C：100 (4 h)；D：200 (4 h)；E：100 (24 h)；F：200 (24 h)
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