發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 19:39

　　 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡(jiǎn)稱金葡菌)既是共生菌組成成分,也是侵襲性感染的主要原因。盡管對(duì)金葡菌感染的致病機(jī)理及其與宿主的相互作用進(jìn)行了大量研究,但宿主清除金葡菌的機(jī)制仍未完全闡明,阻礙了控制該病原感染新策略的發(fā)展。天然免疫系統(tǒng)在早期識(shí)別和清除入侵病原體中起著關(guān)鍵作用。天然免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs)感知病原,啟動(dòng)宿主防御機(jī)制。干擾素誘導(dǎo)蛋白204(IFI204,其人類同源蛋白為IFI16)是PRRs中的DNA傳感器。有關(guān)IFI16/IFI204參與免疫反應(yīng)的研究目前多集中于對(duì)病毒基因組的識(shí)別和抑制病毒復(fù)制方面,此外還有數(shù)篇關(guān)于其介導(dǎo)宿主細(xì)胞對(duì)幾種胞內(nèi)菌的識(shí)別和反應(yīng)的相關(guān)研究報(bào)道,都是在體外基因敲降的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。未見(jiàn)到有關(guān)IFI16/IFI204介導(dǎo)胞外菌識(shí)別的相關(guān)研究。盡管金葡菌也能在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)和傳播,但通常被認(rèn)為是細(xì)胞外致病菌。本課題應(yīng)用IFI204基因缺失小鼠研究了IFI204在宿主防御金葡菌感染中的作用。在金葡菌呼吸道感染實(shí)驗(yàn)中,與WT(野生型)對(duì)照小鼠相比,IFI204~(-/-)(IFI204基因缺失型)小鼠的肺、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血液中的荷菌量更多,肺損傷更加嚴(yán)重。在金葡菌全身性感染實(shí)驗(yàn)中,IFI204~(-/-)小鼠的存活率顯著低于WT小鼠,血液和腎臟中具有更高的荷菌量,腎損傷更加嚴(yán)重。此外,金葡菌呼吸道感染顯著促進(jìn)WT小鼠肺組織、BALF以及血液中細(xì)胞因子(IL-6,IL-1β、IFN-β)和趨化因子(KC/CXCL1?CXCL2?CXCL10)的表達(dá),以及肺組織嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化。但感染后IFI204~(-/-)小鼠這些細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)水平和肺內(nèi)炎性細(xì)胞募集量都顯著低于WT對(duì)照。這表明IFI204參與了宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖,減輕組織病理?yè)p傷,降低死亡率,并能在感染早期促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌和炎性細(xì)胞募集,在宿主防御金葡菌感染中發(fā)揮著不可或缺的保護(hù)作用。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IFI204在金葡菌感染小鼠肺組織中主要表達(dá)于募集的炎性細(xì)胞,還發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)的IFI204主要定位于細(xì)胞核,且金葡菌能顯著上調(diào)其表達(dá),故以小鼠巨噬細(xì)胞作為體外研究的主要細(xì)胞。金葡菌明顯誘導(dǎo)了WT巨噬細(xì)胞IFN-β和KC的表達(dá),而感染后IFI204~(-/-)巨噬細(xì)胞IFN-β和KC的表達(dá)水平顯著低于WT對(duì)照。IFI204對(duì)金葡菌基因組DNA誘導(dǎo)的IFN-β和KC表達(dá)具有相似的調(diào)節(jié)作用。這進(jìn)一步證實(shí)了IFI204促進(jìn)金葡菌誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌。針對(duì)其信號(hào)傳遞機(jī)制的研究中,結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分析了在DNA觸發(fā)的IFN-β誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的STING-IRF3信號(hào)通路,以及在炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起關(guān)鍵作用的NF-κB信號(hào)通路。在IFI204~(-/-)巨噬細(xì)胞中,金葡菌或其基因組DNA誘導(dǎo)的STING和IRF3活化水平顯著低于WT巨噬細(xì)胞,并且NF-κB信號(hào)也受損。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致,證明IFI204促進(jìn)了金葡菌誘導(dǎo)STING-IRF3和NF-κB炎性信號(hào)的活化。此外,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組細(xì)胞因子rKC和rIFN-β都不能抑制金葡菌呼吸道感染IFI204~(-/-)小鼠肺組織和血液中的細(xì)菌增殖,而用anti-IFNAR1單克隆中和抗體阻斷I型IFN信號(hào)反而顯著降低了金葡菌全身性感染IFI204~(-/-)小鼠的死亡率,表明IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保護(hù)作用并不依賴于炎性細(xì)胞因子IFN-β和KC。為明確IFI204抗金葡菌感染免疫防御作用的機(jī)制,進(jìn)而針對(duì)IFI204~(-/-)吞噬細(xì)胞對(duì)金葡菌的吞噬作用、胞內(nèi)殺傷和胞外殺傷分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),以探討IFI204對(duì)吞噬細(xì)胞金葡菌清除能力的影響。金葡菌感染的IFI204~(-/-)巨噬細(xì)胞與WT巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的活金葡菌或熱滅活金葡菌數(shù)量相等,慶大霉素處理后細(xì)胞內(nèi)存活的金葡菌數(shù)量也相等,但I(xiàn)FI204~(-/-)巨噬細(xì)胞胞外活菌數(shù)量顯著多于WT巨噬細(xì)胞。這表明IFI204并不影響巨噬細(xì)胞對(duì)金葡菌的內(nèi)吞和胞內(nèi)殺傷,但能促進(jìn)其胞外殺菌活性。胞外誘捕網(wǎng)(ETs)是天然免疫防御中的一種胞外殺菌機(jī)制。與WT對(duì)照細(xì)胞相比,金葡菌感染后的IFI204~(-/-)巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的ETs形成顯著減少,胞外殺菌能力下降。IFI204缺失也抑制PMA誘導(dǎo)的胞外DNA釋放,表明IFI204能促進(jìn)吞噬細(xì)胞ETs形成,提高其胞外殺菌能力。為進(jìn)一步證實(shí),對(duì)小鼠移植骨髓細(xì)胞后,再進(jìn)行金葡菌呼吸道感染。與接受IFI204~(-/-)小鼠骨髓細(xì)胞的IFI204~(-/-)受體小鼠相比,接受WT小鼠骨髓細(xì)胞的IFI204~(-/-)受體小鼠感染后荷菌量較少、肺組織損傷較輕,炎性細(xì)胞募集增加、MPO活性增加,肺中的促炎細(xì)胞因子(KC、IL-1β、IL-6)也表現(xiàn)為相似變化趨勢(shì)。這表明移植WT小鼠的骨髓細(xì)胞能夠挽救IFI204~(-/-)小鼠由于金葡菌感染造成的肺損傷,恢復(fù)其炎性細(xì)胞募集能力和金葡菌清除能力,證實(shí)IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保護(hù)作用依賴于骨髓來(lái)源的吞噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞。綜上所述,本課題證明了IFI204參與宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖和組織病理?yè)p傷,從而在金葡菌感染時(shí)對(duì)宿主起到保護(hù)作用,并能在感染早期促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌和炎性細(xì)胞募集。然而,IFI204的這一保護(hù)作用并不依賴于炎性細(xì)胞子IFN-β和KC,但依賴于骨髓來(lái)源的吞噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞,且IFI204能促進(jìn)金葡菌感染吞噬細(xì)胞ETs形成,從而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的胞外殺菌能力。這些發(fā)現(xiàn)揭示了IFI204在宿主防御胞外菌金葡菌感染中的重要作用和機(jī)制。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文應(yīng) 1 分鐘，35 個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng) 10 分鐘，4℃降溫。電泳跑膠，條帶為 482 bp，IFI204-/-小鼠的目的條帶為 582 bp。鑒定結(jié)果如物信息如下：因 引物序列 產(chǎn)04 WT上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC4下游 GCTAGAGCAAGATACCAACACTCG4 mutant上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC5下游 TCTGAGGCGGAAAGAACCAG

圖 1.2 金葡菌呼吸道感染后 IFI204-/-小鼠荷菌量高于 WT 小鼠Figure 1.2 IFI204-/-mice had higher bacterial burden compare with WT mice afteStaphylococcus pulmonary infection.A.肺臟；B.支氣管肺泡灌洗液；C.腎臟；D.肝臟；E.脾臟；F.血液；*p<0.05A.Lung；B.BALF；C.Kidney；D.Liver；E.Spleen；F.Blood；*stands for p<0.0病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，肉眼觀察小鼠肺臟病變情況，發(fā)現(xiàn)金葡菌呼吸道感染肺臟都可見(jiàn)深紅色的病變區(qū)，但 IFI204-/-小鼠肺組織眼觀病變與 WT 對(duì)照小比更嚴(yán)重（圖 1.3）。金葡菌呼吸道感染肺組織切片 H&E 染色觀察，發(fā)現(xiàn)未小鼠支氣管腔、肺泡腔內(nèi)沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)完整；金葡菌感染 W鼠肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，肺泡減少，肺泡間隔毛細(xì)血管充血葡菌感染 IFI204-/-小鼠的肺組織損傷更為嚴(yán)重，可見(jiàn)肺組織嚴(yán)重充血，甚至實(shí)變，肺泡萎縮、消失或融合成肺大泡（圖 1.4）。這提示 IFI204 對(duì)金葡菌呼

圖 1.3 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺組織眼觀病變與 WT 小鼠相比更嚴(yán)重Figure 1.3 The pathological changes in lung tissues of IFI204-/-mice were moresevere compare with WT mice after Staphylococcus pulmonary infection.圖 1.4 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺病理學(xué)損傷與 WT 小鼠相比更嚴(yán)重
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