發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 06:39

　　 毛囊干細(xì)胞(Hair follicle stem cells)位于毛囊隆突部(Hair Bulge),屬于成體干細(xì)胞,具有多向分化潛能,是毛囊(Hair follicle)中的原始細(xì)胞,能通過(guò)自身的分裂增殖產(chǎn)生多種機(jī)體所需的細(xì)胞,與毛發(fā)周期的維持、皮膚組織的更新和損傷修復(fù)等密切相關(guān)。毛囊干細(xì)胞與毛囊周期狀態(tài)密切相關(guān),毛囊周期根據(jù)毛囊干細(xì)胞活躍程度和毛囊形態(tài)劃分為三個(gè)階段:生長(zhǎng)期、退化期和休止期。目前分離毛囊干細(xì)胞的方法主要分為機(jī)械分離法和酶消化法,本研究比較了國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)毛囊干細(xì)胞分離純化的方法,通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)找到了兩種體外分離培養(yǎng)長(zhǎng)江三角洲白山羊毛囊干細(xì)胞的方法,分別命名為“毛囊法”和“組織塊法”,通過(guò)比較兩種方法體外分離培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、復(fù)蘇存活率、克隆形成率以及毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平,找到了效果最好的方法。本研究還構(gòu)建了 CMTM3的過(guò)表達(dá)和干擾腺病毒載體,探究其在長(zhǎng)江三角洲白山羊毛囊干細(xì)胞增殖過(guò)程中的生物學(xué)功能;同時(shí)我們還研究了生理濃度的雄激素(優(yōu)質(zhì)筆料毛個(gè)體血液中雄激素濃度)對(duì)于毛囊干細(xì)胞增殖的影響。本研究表明:(1)采用毛囊法分離培養(yǎng)的原代毛囊干細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快,增殖分裂狀態(tài)良好,呈現(xiàn)典型的鋪路石狀,毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物陽(yáng)性率達(dá)到90%以上。組織塊法分離培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞在細(xì)胞活力、毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物陽(yáng)性率等方面遜色于毛囊法,但是該方法操作簡(jiǎn)單、方便。(2)提高CMTM3基因在毛囊干細(xì)胞中的表達(dá)水平后,DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HSPA1mRNA的表達(dá)水平顯著上升(P0.05);轉(zhuǎn)染干擾腺病毒載體并添加生理濃度的雄激素后DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HASP mRNA的表達(dá)水平顯著上升(P0.05),FLNA、FOS mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。(3)Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)腺病毒載體后MAP3K1、DUSP1、FOS、HSPA1蛋白的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P0.01),培養(yǎng)基中添加生理濃度的雄激素后MAP3K1、DUSP1蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P0.01);在轉(zhuǎn)染干擾載體后MAP3K1、DUSP6、HSPA1蛋白的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P0.01)。(4)提高毛囊干細(xì)胞中CMTM3基因的水平可以使細(xì)胞活力下降,同時(shí)G1期的細(xì)胞比例顯著上升(P0.05),毛囊干細(xì)胞的凋亡率顯著上升(P0.05);轉(zhuǎn)染干擾腺病毒載體后細(xì)胞活力增強(qiáng),S和G2期的細(xì)胞比例顯著上升;在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加生理濃度的雄激素能使細(xì)胞活力增加,S和G2期的細(xì)胞比例顯著上升。表明抑制毛囊干細(xì)胞中CMTM3基因的表達(dá)和添加生理濃度的雄性激素都可以都促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖,二者的作用相互協(xié)同。(5)雄性激素受體(AR)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)在優(yōu)質(zhì)筆料毛組的水平最高(P0.05),在去勢(shì)公羊組中最低,VEGFA、IGF-1在去勢(shì)公羊組中表達(dá)水平最高。推測(cè)高水平的EGF有利于長(zhǎng)江三角洲白山羊優(yōu)質(zhì)筆料毛的產(chǎn)生,高水平的VEGFA、IGF-1可能會(huì)促使非優(yōu)質(zhì)筆料毛個(gè)體和去勢(shì)公羊產(chǎn)生普通的粗毛。綜上所述,本研究建立了兩種分離長(zhǎng)江三角洲白山羊毛囊干細(xì)胞的方法,通過(guò)“毛囊法”體外分離培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞細(xì)胞活力更高并且毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)量最高。在毛囊干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾CMTM3基因的表達(dá)水平可以影響毛囊干細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)水平,提高毛囊干細(xì)胞中CMTM3基因的表達(dá)水平可以抑制毛囊干細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;抑制毛囊干細(xì)胞中CMTM3基因的表達(dá)水平可以促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖,增加G2、S期細(xì)胞的比例,抑制細(xì)胞凋亡;在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加生理濃度的雄激素也能促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖;抑制毛囊干細(xì)胞中CMTM3基因的表達(dá)水平并添加生理濃度的雄激素對(duì)毛囊干細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用最為顯著。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

但是髓質(zhì)層不是貫通于整根毛纖維，而是呈斷續(xù)狀態(tài)。一、二類毛分布范圍廣泛，??一般普通的山羊品種都能生成，而長(zhǎng)江三角洲白山羊除生成一類、二類毛外，還能產(chǎn)生三??類毛。三類毛在羊體上有一定的著生部位，只著生在頸脊部，如圖１－１，ｆ所示。??１．３毛囊結(jié)構(gòu)及其功能??毛囊（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ）位于真皮層（Ｄｅｒｍａｌ丨ａｙｅｒ），是哺乳動(dòng)物最為獨(dú)特和復(fù)雜的微型器官??之一ｌ３】，在解剖學(xué)上毛囊與其相鄰結(jié)構(gòu)汗腺（Ｓｗｅａｔ?ｇｌａｎｄｓ）、皮脂腺（Ｓｅｂａｃｅｏｕｓ?ｇｌａｎｄ）和立??毛�。ǎ粒颍颍澹悖簦铮颍穑椋欤�?ｍｕｓｃｌｅ）構(gòu)成毛囊皮脂腺單位［３】，如圖１－２所示。??

?、一汗腺?靜脈??圖１－２毛囊結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??毛囊由２０種以上的細(xì)胞組成，每種細(xì)胞都有不同的功能，毛囊通過(guò)激素（Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）、??神經(jīng)肽（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）和免疫細(xì)胞（Ｉｍｍｕｎｅ?ｃｅｌｌｓ）１３１之間的復(fù)雜相互作用誘導(dǎo)毛囊產(chǎn)生不同??類型的毛囊細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長(zhǎng)。在豎毛肌附近的毛囊外側(cè)有一個(gè)突出的部位，稱??為毛囊隆突（Ｈａｉｒ?ｂｌｕｇ），內(nèi)含毛囊干細(xì)胞（Ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ）。毛囊的上皮組織包括內(nèi)根??

對(duì)于羊毛生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制、毛囊生長(zhǎng)規(guī)律等研究有著重要的作用。??２．２材料與方法??本小節(jié)實(shí)驗(yàn)路線流程如圖２－１所示。??２．２．１實(shí)驗(yàn)材料??本試驗(yàn)的山羊來(lái)源于海門市海門山羊種羊場(chǎng)，選取１２０胎齡左右的雄性胎羊頸背部的??皮膚，先用手術(shù)刀刮干凈表面的羊毛，酒精消毒，用手術(shù)刀割下２ｃｍ?ｘ?２ｃｍ大小的完好皮??膚組織，該皮膚組織樣包含表皮層、真皮層、皮下結(jié)締組織。用生理鹽水洗凈，７５％酒精??
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