發(fā)布時間：2020-11-23 20:17

　　 磺胺類藥物是一類用于治療細菌引起的各種感染的獸用抗菌藥物,但由于過度濫用或停藥期不足造成藥物在動物組織內殘留;最終通過食物鏈進入人體并威脅人類生命健康,如引起肝腎損傷,末梢神經炎或溶血性貧血等疾病;另外,長期使用該類藥物甚至導致多種細菌產生抗藥性(如:鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)耐磺胺類的抗性基因,Sul1),導致細菌感染性疾病的治療越來越困難;因此,國內外對磺胺類藥物殘留限量均有嚴格的要求。因此,本文基于各種納米材料和酶輔助信號放大策略設計了三種電化學傳感器分別用于磺胺二甲氧嘧啶(SDM)和鼠傷寒沙門氏菌的耐磺胺類抗性基因(Sul1)的檢測。本文的主要研究內容如下:第一部分基于P-C_(60)-rGO納米復合物和Pt@Au納米顆粒電化學傳感器的制備及其對磺胺二甲氧嘧啶的檢測研究目的:基于納米復合材料制備電化學適體傳感器并用于SDM的檢測分析。方法:制備聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)功能化的C_(60)摻雜的rGO(P-C_(60)-rGO)納米復合物作為電極界面修飾材料,然后用Pt@Au納米顆粒修飾的P-C_(60)-rGO納米復合物通過Pt@Au與-SH之間的相互作用將-SH標記的SDM適體(SBA)固定在電極表面,最后,將修飾電極與不同濃度的SDM溶液孵育,待SBA與SDM結合后,通過循環(huán)伏安法表征GOx的氧化還原中心(FAD/FADH_2)所產生信號的變化情況,掃描速率為100 mV/s,掃描電位范圍為-0.25~-0.65 V。結果:該傳感器的線性范圍為10 fg/mL~50 ng/mL,相關系數(shù)R為0.996,檢測限為8.7 fg/mL;批內RSD約為4.67%,批間RSD約為3.93%;平均回收率為106%~110%。結論:在上述納米材料的基礎上,該傳感器表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和較高的選擇性以及較寬的線性范圍和較低的檢測限。第二部分基于RecJ_f酶輔助目標再循環(huán)和新型Signal tracer適體傳感器的構建及其對磺胺二甲氧嘧啶的檢測研究目的:基于RecJ_f酶輔助目標再循環(huán)策略和新型Signal tracer構建用于SDM檢測的電化學適體傳感器。方法:首先通過Au-S鍵作用將制備好-SH標記的適體(SBA)-捕獲探針(Cp)的雙鏈DNA(dsDNA)固定在金電極表面;當有SDM存在時,SBA與其形成SBA-SDM復合物,從而使dsDNA發(fā)生解離并釋放出Cp。隨后,通過RecJ_f酶選擇性地剪切SBA,并將SDM分子釋放并參與下一個循環(huán)反應,從而實現(xiàn)信號的放大。其次,制備了功能化的富勒烯(C_(60))摻雜的石墨烯(C_(60)-rGO)納米復合物,然后通過π-π作用吸附信號分子甲苯胺藍(Tb)而形成C_(60)-rGO-Tb納米復合物;隨后,制備金納米顆粒修飾的C_(60)-rGO-Tb并用于固定信號探針(Sp)以形成信號探針復合物(Signal tracer);最后,從循環(huán)過程釋放的Cp與Signal tracer雜交,可進一步增強電化學響應信號。結果:該傳感器的線性范圍為10 fg/mL~10 ng/mL,相關系數(shù)R為0.990,檢測限約為10 fg/mL;平均回收率為98.0%~105%;批內RSD約為3.70%,批間RSD約為2.70%。結論:基于上述的多重信號放大策略,該適體傳感器的選擇性高,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,同時具有較寬的線性范圍和較低的檢測限。第三部分基于PAMAM-MoS_2-C_(60)、酶促目標循環(huán)策略和新型Signal marker構建的DNA傳感器及其對Sul1的檢測研究目的:基于納米復合材料、酶促目標循環(huán)策略和新型Signal marker構建檢測Sul1的電化學DNA傳感器。方法:首先制備了聚乙二胺(PAMAM)功能化的C_(60)摻雜的二硫化鉬(MoS_2)納米復合物(P-MoS_2-C_(60))修飾玻碳電極表面。將制備捕獲探針(Cp)和輔助探針(Ap)部分互補的雙鏈DNA(pdsDNA)固定在P-MoS_2-C_(60)修飾的電極上;然后,當目標DNA存在時,可與pdsDNA形成完全互補的雙鏈DNA(cdsDNA),exo III可從3'端至5'端剪切cdsDNA中的Ap。之后,目標DNA被釋放并與另一個pdsDNA雜交以啟動下一次循環(huán)過程,如此往復,最終釋放出大量單鏈Cp。此外,還制備了金納米粒子(AuNPs)修飾的MoS_2摻雜的聚苯胺(MoS_2-PANI-Au)納米復合材料用于固載信號探針(Sp),從而得到新型信號標記物(Signal marker)。最后,電極表面的單鏈Cp與Signal marker雜交之后可進一步提高電化學信號。結果:該傳感器在40 fM至40 nM的濃度范圍呈線性關系,相關系數(shù)R為0.994,檢測限為29.6 fM。批間和批內RSD均小于1.00%;平均回收率為98.0%~103%。結論:通過上述各種信號放大策略,該生物傳感器對目標DNA的檢測顯示出較高的靈敏度和特異性;更重要的是,它還對從鼠傷寒沙門氏菌中獲得的Sul1的PCR產物表現(xiàn)出較高的特異性和靈敏度,該傳感器可為Sul1檢測提供一個新的參考。
【學位單位】：
【部分圖文】：

圖 1.1 電化學適體傳感器用于 SDM 檢測的原理Figure 1.1 The Schematic illustration of stepwise construction procedure of the aptasensor1.2 實驗部分.2.1 試劑材料表 1.1 整個實驗中使用的溶液組成Table 1.1 The consists of solutions used through the whole experimentSolutions Reagents10 mM Tris–HCl(pH 7.4, 200 mL)三（羥甲基）氨基甲烷（Tris） (2.423 g), 濃鹽酸 (700 μL)0.1 M phosphate buffer(PBS，pH 7.0, 500 mL)NaH2PO4·2H2O (2.965 g), Na2HPO4·12H2O (11.103 g)KCl (0.373 g), MgCl2(0.095 g)5 mMK4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6KCl (0.372 g), K4Fe(CN)6(0.092 g), K3Fe(CN)6(0.0825 g)10 mM Tris 鈉鹽緩沖液（pH 7.4, 200 mL）10 mM Tris–HCl (pH 7.4，20 mL), 乙二胺四乙酸(EDTA, 0.059 NaCl (1.172 g)

圖 1.2 (A) C60-甲苯溶液，(B) nano-C60，(C) GO，(D) P-C60-rGO，(E) Pt@Au-P-C60-rGO FESEM 圖; (F) C60(曲線 a)，GO (曲線 b)和 P-C60-rGO(曲線 c)的 FTIR 圖。Figure 1.2 FESEM images of (A) C60in toluene, (B) nano-C60, (C) GO, (D) P-C60-rGO, (EPt@Au-P-C60-rGO, (F) FTIR image of the C60(curve a), GO (curve b) and P-C60-rGO (curc)..3.2 P-C60-rGO 的用量優(yōu)化P-C60-rGO 納米復合材料不僅能有效增加 GOx 的吸附量，同時也能大大提體傳感器的穩(wěn)定性，因此，本文研究了不同劑量的 P-C60-rGO 的 CV 響應情況圖 1.3 所示，當 P-C60-rGO 的劑量為 8 μL 時，GOx 的 CV 響應達到了最大凈值。因此，在整個實驗過程中，選擇 8 μL 作為 P-C60-rGO 納米復合材料的用量

圖 1.2 (A) C60-甲苯溶液，(B) nano-C60，(C) GO，(D) P-C60-rGO，(E) Pt@Au-P-C60-rGO FESEM 圖; (F) C60(曲線 a)，GO (曲線 b)和 P-C60-rGO(曲線 c)的 FTIR 圖。Figure 1.2 FESEM images of (A) C60in toluene, (B) nano-C60, (C) GO, (D) P-C60-rGO, (EPt@Au-P-C60-rGO, (F) FTIR image of the C60(curve a), GO (curve b) and P-C60-rGO (curc)..3.2 P-C60-rGO 的用量優(yōu)化P-C60-rGO 納米復合材料不僅能有效增加 GOx 的吸附量，同時也能大大提體傳感器的穩(wěn)定性，因此，本文研究了不同劑量的 P-C60-rGO 的 CV 響應情況圖 1.3 所示，當 P-C60-rGO 的劑量為 8 μL 時，GOx 的 CV 響應達到了最大凈值。因此，在整個實驗過程中，選擇 8 μL 作為 P-C60-rGO 納米復合材料的用量
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