發(fā)布時間：2020-11-16 01:38

【摘要】：目的支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是嚴(yán)重威脅早產(chǎn)兒尤其極早早產(chǎn)兒的一種常見肺部疾病。前期研究發(fā)現(xiàn),在高氧誘導(dǎo)的BPD中,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(type II alveolar epithelial cells,AECⅡs)凋亡增加,且通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡途徑活化。但CHOP表達(dá)改變對高氧暴露后AECⅡs凋亡是否產(chǎn)生影響,目前尚不清楚。本研究主要通過檢測被CHOP-siRNA轉(zhuǎn)染的AECⅡs細(xì)胞株在高氧暴露后CHOP、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平以及AECⅡs凋亡情況,探討阻斷內(nèi)源性CHOP表達(dá)對高氧暴露AECⅡs凋亡的影響。方法體外設(shè)計合成靶向CHOP基因的siRNA堿基序列,采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)法對AECⅡs細(xì)胞進(jìn)行pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA及pcDNA3.1(+)-空質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染,RT-PCR和Western blot檢測siRNA干擾后CHOP基因沉默效果。轉(zhuǎn)染后24 h給予高氧暴露,將細(xì)胞分為空氣組、空氣+pcDNA3.1(+)-空質(zhì)粒組、空氣+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組、高氧組、高氧+pcDNA3.1(+)-空質(zhì)粒組、高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),于空氣或高氧暴露48 h收集各組細(xì)胞,Annexin V/PI雙染法及流式儀檢測早期細(xì)胞凋亡,RT-PCR及Western blot檢測CHOP、Bcl-2及Bax表達(dá)水平。結(jié)果(1)空氣組AECⅡs伸出較多偽足,緊貼于瓶底,呈島狀生長方式,空氣+pcDNA3.1(+)-空質(zhì)粒組及空氣+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組細(xì)胞形態(tài)與空氣組相比無明顯差異;高氧組AECⅡs伸展肥大明顯,細(xì)胞貼壁不緊,偽足減少,核仁減少或消失,培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞數(shù)增加,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空泡改變,高氧+pcDNA3.1(+)-空質(zhì)粒組與高氧組相比無明顯差異;高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組細(xì)胞形態(tài)較空氣組稍有伸展肥大,但較高氧組細(xì)胞伸展程度變小,懸浮細(xì)胞數(shù)減少,且細(xì)胞無空泡改變。(2)與空氣組相比,高氧組AECⅡs凋亡明顯增加,CHOP基因mRNA及蛋白表達(dá)增加,Bcl-2基因mRNA及蛋白減少,Bax基因mRNA及蛋白表達(dá)增加。(3)AECⅡs轉(zhuǎn)染CHOP-siRNA后,與高氧組相比,高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組AECⅡs凋亡減少,CHOP基因mRNA及蛋白表達(dá)減少,Bcl-2基因mRNA及蛋白表達(dá)增加,Bax基因mRNA及蛋白表達(dá)減少。結(jié)論(1)高氧可導(dǎo)致AECⅡs凋亡增加,CHOP表達(dá)增加,抗凋亡基因Bcl-2減少,促凋亡基因Bax增加,提示高表達(dá)的CHOP可通過下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)及促進(jìn)促凋亡基因Bax的表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。(2)AECⅡs轉(zhuǎn)染CHOP-siRNA阻斷CHOP表達(dá)后,可減輕高氧誘導(dǎo)的AECⅡs凋亡。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R722.6
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞
第一章 前言
    1.1 研究背景
    1.2 主要研究內(nèi)容、目標(biāo)及意義和技術(shù)路線
        1.2.1 主要研究內(nèi)容
        1.2.2 主要研究目標(biāo)
        1.2.3 主要研究意義
        1.2.4 技術(shù)路線
第二章 siRNA沉默CHOP基因?qū)Ω哐醣┞禔ECⅡs凋亡的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗用細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要試劑的配制
        2.1.4 主要設(shè)備和器材
    2.2 實驗方法
        2.2.1 AECⅡs培養(yǎng)
        2.2.2 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA及pcDNA3.1（+）-空質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        2.2.3 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染效果檢測
        2.2.4 高氧細(xì)胞損傷建立及分組
        2.2.5 倒置相差顯微鏡觀察AECⅡs形態(tài)
        2.2.6 RT-PCR檢測各組細(xì)胞CHOP、Bcl-2及BaxmRNA表達(dá)
        2.2.7 Western blot檢測各組細(xì)胞CHOP、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)
        2.2.8 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡
    2.3 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 pcDNA3.1（+）-空質(zhì)粒及pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果
        2.4.2 倒置相差顯微鏡觀察AECⅡs形態(tài)
        2.4.3 CHOP-siRNA對CHOP基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        2.4.4 CHOP-siRNA對Bcl-2基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        2.4.5 CHOP-siRNA對Bax基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        2.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CHOP沉默對細(xì)胞早期凋亡的影響
    2.5 討論
第三章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述 肺泡上皮細(xì)胞凋亡介導(dǎo)肺損傷的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的論文

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