發(fā)布時間：2020-11-18 22:55

【摘要】： 前言 早產(chǎn)兒慢性肺疾病(CLD)是早產(chǎn)兒在肺發(fā)育未成熟的基礎上，因高氧、感染，氣壓傷等原因引起肺部的遠期合并癥。早產(chǎn)兒CLD作為早產(chǎn)兒肺透明膜病治療的并發(fā)癥在1967年首次被Northway描述，也稱為支氣管肺發(fā)育不良(BPD)。氧療法是患有心肺疾病的早產(chǎn)兒最常應用的一種治療手段。這一措施雖可改變患兒的低血氧狀態(tài)、挽救患兒的生命，但長期吸入高濃度的氧氣，可引起不同程度的肺損傷，嚴重者可發(fā)展為CLD。隨著新生兒醫(yī)學的不斷發(fā)展，重癥搶救技術(shù)水平的提高，使得CLD的發(fā)病率呈逐漸增高趨勢(30％～40％)。由于目前尚無有效的預防和治療方法。高氧后早產(chǎn)兒CLD已成為NICU最為棘手的問題之一。 目前CLD發(fā)生機制的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點之一，雖然大量臨床和動物實驗從氧化應激性肺損傷、炎癥反應、細胞凋亡和某些生長因子不足介導的肺發(fā)育障礙等諸多角度闡明了CLD的發(fā)生和發(fā)展過程，但其確切的發(fā)生機制仍不詳。不論病因如何，CLD的特征性病理改變是肺發(fā)育受阻和肺間質(zhì)纖維化。早產(chǎn)兒CLD目前尚無有效的治療方法，早在上世紀90年代糖皮質(zhì)激素是預防和治療的治療早產(chǎn)兒CLD的常規(guī)用藥，用來減輕肺水腫、局部炎癥反應并減少患者對氧的依賴程度，但越來越多臨床研究表明：糖皮質(zhì)激素影響肺分支發(fā)育、腦發(fā)育和體格發(fā)育，已很少應用。早期預防性應用表面活性物質(zhì)替代療法可改善肺功能，但不能降低CLD的發(fā)病率。因此研究其發(fā)病機制，尋求如何逆轉(zhuǎn)高氧誘導的肺泡發(fā)育阻滯、減輕肺間質(zhì)廣泛纖維化、減少新生兒CLD發(fā)生成為新生兒醫(yī)生面臨的一個緊迫待解決的課題。 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是作用于血管的辛肽化合物，由于其通過收縮血管和鈉潴留來控制血壓和容量自體穩(wěn)定而一直受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在許多組織中存在局部的RAS能獨立于循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生AngⅡ的前體，并發(fā)現(xiàn)AngⅡ在組織損傷、纖維化過程中可能扮演重要的角色。體外實驗證實AngⅡ通過AT1R促進培養(yǎng)的肺泡上皮細胞(AEC)調(diào)亡；刺激肺FB自分泌TGF-β1進而促進FB增殖和分化、膠原沉積；還有人認為AngⅡ可能通過與AT1R結(jié)合通過調(diào)控MMPs/TIMPs的合成及活化、參與組織重塑的過程；另外肺循環(huán)或肺實質(zhì)內(nèi)激活的局部RAS系統(tǒng)還能通過增加血管滲透性、增加血管緊張度等多個機制參與肺損傷的發(fā)生。應用ACEI和AT1R拮抗劑能夠減輕博萊霉素誘導肺纖維化的進展。推測肺局部的RAS在肺纖維化發(fā)病過程中具有重要的作用。 關(guān)于RAS系統(tǒng)在高氧致新生大鼠CLD發(fā)病中的作用研究尚少。Li研究發(fā)現(xiàn)在高氧刺激后新生大鼠肺組織中AngⅡ和ACE水平上升，并且應用開博通可減輕肺纖維化。但其確切機制不清。本研究計劃將新生鼠暴露于85％高氧環(huán)境發(fā)病中，制造CLD的動物模型，同時給特異性AT1R拮抗劑losartan干預，通過組織病理、形態(tài)學分析并且進一步從蛋白、基因水平等方法進行檢測，從肺局部RAS的受體水平來研究在高氧致新生大鼠CLD發(fā)病機制，探討losartan抗肺纖維化可能的作用機制，為尋求早產(chǎn)兒CLD的治療提供新思路。 實驗材料與方法 一、動物模型 本實驗是在中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院實驗動物中心完成。足月新生Wistar大鼠(連同母鼠)被隨機分為4組：AIR組、空氣對照組；O_2組、單純高氧暴露組；AO_2組、高氧+注射用水組；LO_2組、高氧+losartan組。將2-4組在生后24 h內(nèi)置于玻璃氧艙中，持續(xù)輸入氧氣，維持在FiO_2 0.85，每日兩次監(jiān)測氧濃度(美國OM-25ME型測氧儀監(jiān)測)，用鈣石灰吸收CO_2，使其濃度小于0.5％(美國Dapex氣體分析儀)，溫度20℃～25℃，濕度50％～70％，每天開箱0.5h，稱重，添加水及飼料，更換墊料，與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護理能力降低；空氣對照組置于空氣中(FiO_2 0.21)，飼養(yǎng)條件與高氧組相同。3、4組于生后6d每天分別經(jīng)胃管灌服注射用水(3ml/kg)、losartan(5mg/kg/d，注射用水3ml/kg配成混懸液)，直至實驗結(jié)束。 二、標本采集和處理 每組分別于實驗開始后的第1、3、7、14、21天分別從中隨機抽取8只，腹腔注射5％水合氯醛6ml/kg麻醉后處死。立即打開胸腔，無菌條件下分離肺組織，取右肺各葉置于無Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛(0.1MPBS，pH7.0～7.6)固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。 三、實驗方法 (一)、一般狀況觀察 動態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)和死亡情況、監(jiān)測體重，并比較時點生存率和生存曲線。 (二)、病理形態(tài)學研究 1、光鏡觀察：切片進行常規(guī)HE染色，光鏡下動態(tài)觀察肺組織的病理改變。 2、肺泡間隔厚度測定： 3、Masson三聯(lián)染色動態(tài)觀察肺組織內(nèi)的膠原纖維沉積。 (三)、采用免疫組化、RT-PCR檢測肺組織AT1R的表達 (四)、各組膠原蛋白含量和基因表達的動態(tài)變化 1、免疫組化方法檢測肺組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在肺組織中表達的強度和部位。 2、酸解法檢測肺組織羥脯氨酸的含量，間接反映肺組織膠原的含量。 3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)動態(tài)檢測肺組織Ⅰ型膠原蛋白(ColI)的含量變化。 4、RT-PCR技術(shù)檢測肺組織ColI mRNA的表達。 (五)、采用免疫組化、RT-PCR技術(shù)檢測肺組織MMP-13和TIMP-1表達的變化 四、統(tǒng)計學分析 應用SSPS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以均值±標準差((?)±s)表示，多組間比較采用方差分析(F檢驗)。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent t test。相關(guān)性分析；生存率的估計使用壽命表法，時點生存率的比較用u檢驗。結(jié)果以P0.05有意義。 結(jié)果 一、高氧及Losartan干預后新生大鼠一般狀態(tài)和生存率的變化 O_2組新生鼠一般在5～7d后出現(xiàn)少動、呼吸急促、皮膚蒼白以及離氧后不同程度的發(fā)紺，隨高氧暴露時間延長而逐漸加重，在10d后出現(xiàn)對氧的依賴。LO_2組新生大鼠在離氧后的耐受能力好于高氧組。而AIR組則無以上異常表現(xiàn)。 隨著高氧暴露時間的延長，O_2組新生大鼠生存率下降(P0.05)；其中LO_2組新生大鼠存活率較O_2組增加；AO_2組同于O_2組；而AIR組，1天后無死亡。 O_2組在高氧暴露7d開始，新生大鼠體重與AIR組相比下降(P0.05)，隨著高氧暴露時間的延長，體重差異逐漸明顯(P0.01)。LO_2組體重與單純O_2組相似。 二、各組新生大鼠肺組織病理形態(tài)學變化的比較 (一)肺組織的病理改變： AIR組1d的肺組織出現(xiàn)小而淺的原始肺泡，形態(tài)不規(guī)則，肺泡間隔較厚；3d時終末氣腔大小降低，數(shù)量漸增多，肺泡間隔漸��；7d-21d肺泡化進一步完善，到21d肺泡間隔變薄，肺泡次級隔明顯增多，肺泡數(shù)量增多，形態(tài)較規(guī)則；O_2組在高氧暴露1d后與AIR組無明顯差別。3d可見小血管擴張、充血，肺泡腔內(nèi)或間隔少量出血，以中性粒細胞為主的滲出、間質(zhì)內(nèi)細胞增多。7d時炎癥反應進一步加重，肺泡間隔水腫變寬，出現(xiàn)終末氣腔擴張、肺泡融合、肺泡分隔減少等。14d-21d間隔增寬，小灶或多灶狀實變，肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，且終末氣腔擴張更為明顯、小肺泡數(shù)量更少，肺泡次級隔明顯減少。AO_2組與O_2組改變相似。而LO_2組在7d與高氧組區(qū)別不明顯，14d、21d肺組織肺泡間隔變薄、纖維化程度明顯減輕，但肺泡腔沒有明顯縮小，且肺泡次級隔仍較少。 (二)Masson染色： 藍色的膠原纖維主要在支氣管及血管壁的外周，肺泡壁有少許。O_2組隨高氧時間的延長，膠原纖維在在支氣管及血管壁的外周沉積增加；在高氧后14d、21d肺泡間隔藍色膠原纖維所占比例較AIR組明顯增加。LO_2組藍色膠原纖維所占比例較O_2組減少且排列比較疏松，但仍明顯高于AIR組。 三、高氧對CLD新生大鼠肺組織AT1R表達的影響 AT1R主要在肺泡上皮細胞、間質(zhì)細胞、間質(zhì)巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞、支氣管和毛細血管外膜有免疫染色；AIR組3d表達增強，之后表達顯著下降，21d僅在肺泡上皮細胞及血管外膜弱表達；而O2組在21d在損傷部位的間質(zhì)巨噬細胞、FB仍有較強的免疫染色。O2組在1d、3d、7d AT1R蛋白和mRNA表達與AIR組無明顯差別(P0.05)，14d和21d時較同期AIR組表達顯著增強(P0.01)， 四、各組膠原蛋白含量和基因表達的動態(tài)變化 (一)α-SMA在肺組織中的表達 免疫組化結(jié)果示：AIR組肺組織，α-SMA表達部位主要在肺血管、氣道壁及呼吸性支氣管開口處平滑肌的胞漿中，同時1d-7d在初級肺泡隔間質(zhì)中表達，到14d、21d時在次級隔頂端有免疫染色。O_2組7d后，α-SMA在管壁平滑肌中表達明顯增強，同時在肺泡間隔有明顯表達；到14d、21d在肺泡表面、間質(zhì)出現(xiàn)彌漫性強的免疫染色。LO_2組α-SMA表達的范圍和強度較O_2組明顯減弱。 (二)酸解法檢測肺組織HYP的含量 在1d-7d各組HYP的含量沒有明顯的區(qū)別。14d和21d O_2組肺組織HYP的含量明顯高于同期AIR組(P0.01)，AO_2組改變同于高氧組；LO_2組HYP的含量在14d較O_2組略有下降，但差異不明顯，到21d則較O_2組下降顯著P(0.01)，但仍明顯高于AIR組(P0.01)。 (三)檢測各組肺組織ColI蛋白及mRNA表達的變化 AIR組ColI的含量均隨日齡增加逐漸下降，而高氧各組逐漸增加(P0.01)。14d O_2組較AIR組顯著上升(P0.01)，21d時差異更為顯著(P0.001)；Losartan干預后14d較高氧組略有下降，但差異不明顯，21d時則顯著下降(P0.01)。 AIR組各時間點ColImRNA表達無明顯差異(P0.05)。O_2組和AO2組ColImRNA表達隨日齡的增加顯著上升，7d差異顯著(P0.01)，21d時達高峰。LO2組在21d時較O_2組顯著下降(P0.01)。 肺組織α-SMA表達與ColImRNA之間呈較強直線相關(guān)關(guān)系(r=0.64，P0.05)；而與ColI蛋白無直線相關(guān)關(guān)系(r=0.28，P0.05)。 五、各組新生大鼠MMP-13和TIMP-1在肺組織表達的變化 (一)MMP-13和TIMP-1在肺組織中的蛋白表達比較 AIR組肺組織MMP-13和TIMP-1的表達部位主要在上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮和間質(zhì)細胞胞漿中。 在AIR組各時間點MMP-13表達沒有明顯的變化(P0.05)；O2和AO2組1d-14d與AIR組無明顯差異(P0.05)；到21d MMP-13表達顯著下降(P0.01)。LO2組在21d較O2和AO2組表達均明顯增強(P0.01)，與AIR組相近(P0.05)。 TIMP-1在高氧7d后增強，14d和21d更為顯著(P0.01)；Losartan在21d抑制高氧肺組織TIMP-1表達(P0.01)，但仍高于AIR組(P0.05)。 (二)MMP-13和TIMP-1在肺組織中的mRNA表達比較 各組肺組織均有MMP-13，TIMP-1 mRNA表達；且mRNA表達與蛋白表達變化趨勢具有一致性。 結(jié)論 1、新生大鼠持續(xù)高濃度氧氣暴露，可導致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學改變，符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特點和解剖學改變。 2、新生大鼠肺組織AT1R主要定位在肺泡上皮細胞、間質(zhì)細胞、間質(zhì)巨噬細胞、支氣管和毛細血管外膜；高氧組在內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞出現(xiàn)陽性染色。AT1R在高氧后期表達明顯增強，與肺纖維化發(fā)生時間一致性的結(jié)果提示AngⅡ作為AT1R配體可能參與高氧CLD的發(fā)生。 3、在高氧暴露的中晚期，在肺泡腔的表面及間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)彌漫性、條索狀α-SMA表達，而在空氣對照組α-SMA在次級隔的頂端呈點狀表達，而在肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)卻罕見表達。推測持續(xù)高濃度氧氣暴露誘發(fā)肺組織MFB表達部位及表達的強度的改變可能是CLD發(fā)生的主要原因之一。 4、Losartan可明顯降低高氧致CLD新生大鼠肺組織α-SMA、Col蛋白和mRNA的表達，降低肺組織HYP的含量；α-SMA與ColI mRNA表達具有顯著相關(guān)性結(jié)果，提示Losartan可能通過抑制肺組織MFB的轉(zhuǎn)化，進而抑制ColI mRNA的表達來減輕高氧CLD新生大鼠肺纖維化。結(jié)果同時暗示高氧致新生大鼠肺組織纖維化的發(fā)生可能通過AngⅡ與AT1R結(jié)合，調(diào)節(jié)ColI合成來介導完成的。 5、MMP-13和TIMP-1在正常肺組織有表達，提示MMP-13和TIMP-1可能在參與肺的形態(tài)構(gòu)建，膠原代謝等過程。 6、在高氧晚期肺組織mmp-13基因和蛋白表達顯著下降；而TIMP-1表達明顯增強。猜測在高氧暴露晚期MMP-13/TIMP-1mRNA和蛋白表達失衡導致膠原降解減弱，這可能是高氧后期以ColI為代表的肺組織ECM異常沉積的關(guān)鍵所在。 7、Losartan可顯著誘導高氧肺組織MMP-13mRNA和蛋白表達，下調(diào)TIMP-1mRNA和蛋白的表達，使得MMP-13/TIMP-1比值得到部分糾正，減少高氧肺組織中ColI的異常沉積。提示：肺局部AngⅡ可能通過與AT1R結(jié)合，通過調(diào)節(jié)MMP-13/TIMP-1的合成與活性來參與高氧CLD的發(fā)生。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R722.6
【圖文】：

兩組新生大鼠體重均隨日齡增加逐漸上升;1d和3d兩組體重比較沒有差別;7d開始，o:組體重增長緩慢，與AIR組相比差異明顯(P<0.05)，14d和Zld差異更為顯著(P<0.01)。具體數(shù)值見表2，圖1表2，兩組新生大鼠體重(g)的變化(x士s)組別體重體重體重n體重n體重AIRO2 705.99土0.71 548.51士 0.854014.40士1.37 2225.27士 2.531141.55士3.05 856.03士 0.6963 8.20士 0.7838 1159土2.31* 2518.50士 2.44**926.71士1.59** *P<0.05， **P<0.01vsAIR:::::)))))))))))))口 口口口 AIRRR .......02223日、一}、哥(d)14圖1，兩組新生大鼠體重的比較(三)兩組新生大鼠生存率的對比:0:組死亡數(shù)目隨著高氧暴露時間的延長逐漸上升，生存率逐漸下降(P<0.05);而AIR組，1d存活98.6%，之后3d一Zld均無死亡口見圖

泡間隔逐漸增寬(P<0.01)。ld和 3dAIR組同0:組比較無明顯差異;7do:組肺泡間隔較同期AIR組明顯增寬(P<0.01)，14d和21d時差異更為顯著(P<0.001)。具體數(shù)值見表3，圖3表3，兩組肺組織肺泡隔厚度扭m)的動態(tài)變化(x士s)grouPSld3d7d14d 2ldAIRO2 6.33士 1.02 6.40士 1.25 5.97士 1.18 6.44士 1.10 5.88士1.14 7.93士4.71* 4.41士0.97 8.48士3.31* 3.66士0.9410，50士 4.84***尸 <0.01，**尸 <0.001vsAIR9︺n曰CO卜八U莊91自︵已n︶側(cè)醚側(cè)逞翌旦1d3d7d日寸f司(d) 2ld圖3，兩組肺組織肺泡間隔厚度比較(四)兩組新生大鼠RAC值對比:AIR組RAC值隨日齡增加逐漸增加;O:組14dRAC值在ld沒有差別，7d時較同期AIR組明顯降低(P<0.05)，14d和Zld護<0.01)。具體數(shù)值見表43d與同期空氣組時差異更為顯著表4，各組肺組織RAc值的動態(tài)變化(x士s)grouPSld3d7d 14d2ldAIRO2 4.12士 1.10 4.25土0.92 5.67士1.26 5.78士 1.31 7.84士0.76 5.27士 1.34* 8.91士0.82521士 1.78**10.25士0.76 3.77土1.92***尸 <0.01
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本文編號：2889325