發(fā)布時間：2018-09-11 21:44

【摘要】：前列腺癌(prostate cancer，PCa)在男性腫瘤中具有很高的發(fā)病率，在美國已成為男性癌癥死因中僅次于肺癌的第二大殺手[1]。傳統(tǒng)的臨床前列腺癌治療方法包括雄激素阻斷治療、手術(shù)治療和藥物去勢治療等。但是隨著時間的推移，幾乎全部患者的前列腺癌類型都將由激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)榉且蕾囆�，也就是激素非依賴性前列腺�?androgen independent prostate cancer，AIPC)，使得原本激素依賴性的癌細胞增殖加速而不受低雄激素水平抑制，最終促進了前列腺癌的進展或轉(zhuǎn)移。到目前為止，對AIPC還尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療辦法。但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療將有望成為癌癥治療的新的有效手段。因此闡明前列腺癌的分子發(fā)病機制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理具有重要的科學(xué)和臨床意義。 TFDP3是一個新的E2F1的直接調(diào)控因子。本課題組前期應(yīng)用組織芯片和原位雜交方法進行了正常組織和癌組織的TFDP3表達分析。實驗證明，該基因并非所謂的睪丸/腫瘤特異的癌基因，而是廣泛表達于多種組織細胞。同時，它的確在多種癌組織中表達增強，尤其是相對于正常情況下不表達TFDP3的肝和前列腺組織中。研究表明TFDP3不僅可以抑制E2F1誘導(dǎo)的細胞增殖活性，而且可以抑制E2F1誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用；可以誘導(dǎo)前列腺癌細胞的自噬作用；提高激素依賴的前列腺癌細胞LNCap的生存能力。TFDP3誘導(dǎo)的自噬功能和抗凋亡效應(yīng)極有可能是前列腺癌由激素依賴性向非依賴性轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵的自我保護機制之一。 本研究通過進一步對TFDP3啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點的分析，發(fā)現(xiàn)TFDP3可能與E2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，本課題首先我們構(gòu)建了包含TFDP3基因啟動子的熒光報告載體，從啟動子水平證實了轉(zhuǎn)錄因子E2F1對TFDP3的調(diào)控作用，其次通過western-blot初步探索TFDP3在E2F1刺激下的蛋白水平的變化，并且利用流式細胞術(shù)在功能水平上證實了TFDP3與E2F1的相互作用對前列腺癌細胞凋亡所造成的影響。最后，通過免疫組化分析前列腺癌組織和正常組織中TFDP3和E2F1的表達水平，證明TFDP3和E2F1在前列腺癌組織中的表達水平相較于正常組織的表達水平均增高；同時，隨著前列腺癌等級的增高，二者的表達水平也增強，并且增高的趨勢相一致。主要研究結(jié)果如下： 1.首先，通過NCBI基因組數(shù)據(jù)庫查找到TFDP3基因ATG上游約1064bp序列，并針對此序列設(shè)計引物。以人的前列腺癌PC3細胞基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴增TFDP3啟動子片段并克隆到pGL3-Basic熒光素酶報告基因上游多克隆位點處，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建包含TFDP3基因啟動子和熒光素酶報告基因的重組載體pGL3-TFDP3-promoter。最后，將構(gòu)建的重組載體pGL3-TFDP3-promoter轉(zhuǎn)染PC3細胞后，檢測熒光素酶的表達活性，以驗證克隆的片斷存在TFDP3的啟動子序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。 進一步與E2F1表達載體共轉(zhuǎn)染PC3細胞后，TFDP3啟動子誘導(dǎo)的熒光素酶活性較單獨轉(zhuǎn)染pGL3-TFDP3-promoter顯著升高(1.14±0.06vs0.61±0.05, P0.05)，證明E2F1可誘導(dǎo)TFDP3轉(zhuǎn)錄。 2．通過轉(zhuǎn)染E2F1表達載體pCMV-E2F1-HA于PC3細胞中，提取蛋白后，經(jīng)Western blot檢測，得到以下實驗結(jié)果：相比未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染E2F1表達載體組的E2F1和TFDP3的表達均有所增加，IOD（TFDP3）/IOD(β-actin)約增加2.7倍（0.089±0.02vs0.24±0.03，P0.05）�？梢奅2F1對TFDP3的蛋白表達具有上調(diào)作用。 3.通過流式細胞儀檢測TFDP3與E2F1相互作用對前列腺癌細胞凋亡的影響可以發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染E2F1表達載體后細胞凋亡率顯著上升(2.66%±0.001vs7.1%±0.003，P0.05)，而與pcDNA3.1-TFDP3共轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率明顯下降（7.1%±0.003vs4.92%±0.002，P 0.05）。因此，，進一步驗證了TFDP3可以在一定程度上抑制由E2F1誘導(dǎo)的前列腺癌細胞凋亡。 4.通過免疫組化檢測前列腺癌組織標本以及正常前列腺組織標本中TFDP3和E2F1的表達情況，結(jié)果顯示：相較正常前列腺組織，前列腺癌組織中TFDP3和E2F1的表達水平均增強，同時隨著前列腺癌等級的增高，TFDP3和E2F1的表達也隨之增長，并且二者的增長趨勢相一致。 綜上所述，本研究通過構(gòu)建TFDP3啟動子區(qū)熒光報告載體pGL3-TFDP3-promoter，并利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)及Western blot初步確定E2F1對TFDP3基因啟動子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄水平和表達水平的調(diào)控作用，證明了E2F1參與該基因表達調(diào)控。此外通過免疫組化檢測正常前列腺組織和前列腺癌組織中TFDP3和E2F1表達水平，并結(jié)合流式細胞術(shù)檢測證實TFDP3可以結(jié)合E2F1進而有效抑制前列腺癌細胞的凋亡，從而在保障前列腺癌細胞生存中發(fā)揮了重要作用。這一現(xiàn)象提示TFDP3可能通過抑制激素缺失條件下前列腺細胞的凋亡，從而促進前列腺癌細胞的生存。
[Abstract]:Prostate cancer (PCa) has a high incidence in male tumors, and has become the second leading cause of cancer death in the United States after lung cancer [1].Traditional clinical treatments for prostate cancer include androgen blockade therapy, surgical treatment and drug castration. Hormone-independent prostate cancer (AIPC) can accelerate the proliferation of hormone-dependent cancer cells without being inhibited by low androgen levels, and ultimately promote the progression or metastasis of prostate cancer. However, with the development of modern molecular biology, gene therapy is expected to become a new and effective method for cancer treatment. Therefore, it is of great scientific and clinical significance to elucidate the molecular pathogenesis and transcriptional regulation mechanism of prostate cancer.
TFDP3 is a new direct regulator of E2F1. Our team used tissue microarray and in situ hybridization to analyze the expression of TFDP3 in normal and cancer tissues. It has been proved that TFDP3 is not a so-called testicular/tumor specific oncogene, but is widely expressed in a variety of tissues and cells. Increased expression in tissues, especially in liver and prostate tissues where TFDP3 is not normally expressed, has been shown to inhibit not only E2F1-induced cell proliferation but also E2F1-induced apoptosis, induce autophagy of prostate cancer cells, and enhance hormone-dependent prostate cancer. The autophagy and anti-apoptosis effects induced by TFDP3 may be one of the key self-protection mechanisms in the transition of prostate cancer from hormone dependence to non-dependence.
In this study, we further analyzed the transcriptional binding sites of TFDP3 promoter region and found that TFDP3 may bind to E2F1 transcription factors. On this basis, we first constructed a fluorescent reporter vector containing TFDP3 gene promoter, and confirmed the regulatory effect of transcription factor E2F1 on TFDP3 at promoter level. Secondly, Western-blo was used to investigate the role of TFDP3 transcription factor E2F1 in TFDP3 transcription. T preliminarily explored the changes of TFDP3 protein level stimulated by E2F1, and confirmed the effect of TFDP3-E2F1 interaction on apoptosis of prostate cancer cells by flow cytometry. Finally, the expression levels of TFDP3 and E2F1 in prostate cancer tissue and normal tissue were analyzed by immunohistochemistry. The expression level in prostate cancer tissues was higher than that in normal tissues. At the same time, with the increase of prostate cancer grade, the expression level of both increased, and the trend was consistent.
1. First, a sequence of about 1064bp upstream of ATG of TFDP3 gene was found by NCBI genomic database, and primers were designed for this sequence. Using human prostate cancer PC3 cell genomic DNA as template, TFDP3 promoter fragments were amplified by PCR and cloned to the upstream polyclonal site of pGL3-Basic luciferase reporter gene. The recombinant vector pGL3-TFDP3-promoter containing TFDP3 gene promoter and luciferase reporter gene. Finally, the constructed recombinant vector pGL3-TFDP3-promoter was transfected into PC3 cells and the luciferase expression activity was detected to verify the existence of TFDP3 promoter sequence or transcriptional regulatory sequence in the cloned fragment.
After co-transfection with E2F1 expression vector, the luciferase activity induced by TFDP3 promoter was significantly higher than that induced by pGL3-TFDP3-promoter alone (1.14 + 0.06vs0.61 + 0.05, P 0.05). It was demonstrated that E2F1 could induce TFDP3 transcription.
2. After transfection of E2F1 expression vector pCMV-E2F1-HA into PC3 cells, the protein was extracted and detected by Western blot. The results showed that the expression of E2F1 and TFDP3 was increased in the E2F1 expression vector group, and the expression of IOD (TFDP3) / IOD (beta-actin) was increased by 2.7 times (0.089 + 0.02vs0.24 + 0.03, P 0.05) compared with the untransfected group. The protein expression was up-regulated.
3. The effect of TFDP3-E2F1 interaction on apoptosis of prostate cancer cells was detected by flow cytometry. It was found that the apoptosis rate of prostate cancer cells increased significantly after transfection of E2F1 expression vector (2.66%+0.001 vs 7.1%+0.003, P 0.05), but decreased significantly after co-transfection with pcDNA3.1-TFDP3 (7.1%+0.003 vs 4.92%+0.002, P 0.05). The results showed that TFDP3 could inhibit the apoptosis of prostate cancer cells induced by E2F1 to some extent.
4. The expression of TFDP3 and E2F1 in prostate cancer tissue and normal prostate tissue were detected by immunohistochemistry. The results showed that compared with normal prostate tissue, the expression of TFDP3 and E2F1 in prostate cancer tissue were increased. At the same time, the expression of TFDP3 and E2F1 increased with the increase of prostate cancer grade. The growth trend of the two is the same.
To sum up, we constructed a fluorescent reporter vector pGL3-TFDP3-promoter for TFDP3 promoter region, and preliminarily determined that E2F1 could regulate the transcriptional and expression levels of TFDP3 promoter region by using dual luciferase detection system and Western blot, which proved that E2F1 was involved in the regulation of TFDP3 gene expression. The expression levels of TFDP3 and E2F1 in normal prostate tissue and prostate cancer tissue were measured. Flow cytometry showed that TFDP3 could bind to E2F1 and inhibit the apoptosis of prostate cancer cells effectively, thus playing an important role in protecting the survival of prostate cancer cells. The apoptosis of prostate cells promotes the survival of prostate cancer cells.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡志全,郭輝,諶科,王志華,余建華,葉章群;姜黃素誘導(dǎo)雄激素非依賴性前列腺癌PC3細胞周期阻滯和凋亡研究[J];中華實驗外科雜志;2005年10期

2 段志文;馬明月;裴秀叢;張玉敏;;低劑量雙酚A及鄰苯二甲酸二乙基己酯對PC3細胞增殖的影響[J];沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年02期

3 武睿毅;王國民;王杭;張立;;內(nèi)皮素-1對紫杉醇誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細胞PC3凋亡的影響[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

4 曾少華;曾國華;李舒玨;梁葉萍;歐莉莉;吳文起;;PARP抑制劑5-AIQ對雄激素非依賴性前列腺癌細胞PC3的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年12期

5 蘇雷;李文思;肖黎;秦盛斐;佟明;;miRNA-21在激素非依賴前列腺癌細胞系PC3中的表達及對其增殖和侵襲性影響[J];東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

6 何毅;張齊梅;章卓;;槲皮素對人前列腺PC3細胞株增殖和凋亡影響[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年04期

7 張志敏;王閣;;PC3~(TIS21/BTG2)基因的研究現(xiàn)狀和進展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2007年04期

8 胡潔淼;邱飛嬋;陰彬;龔燕華;袁建剛;強伯勤;王世真;彭小忠;;生物發(fā)光顯像技術(shù)對血管生成抑制因子vasostatin在腫瘤細胞PC3中活性監(jiān)測[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2007年03期

9 黃忠獻;金訊波;王慕文;張沂南;鄭懿;夏慶華;;丙戊酸對前列腺癌PC3細胞自噬的影響[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

10 蘇琦;許露偉;李文成;王自正;朱金海;賈瑞鵬;;內(nèi)皮素-1對前列腺癌PC3細胞環(huán)氧化酶-2表達的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年04期

相關(guān)會議論文 前8條

1 彭御冰;張明;周娟;盧慕峻;王忠;;通過前列腺間質(zhì)共培養(yǎng)建立激素非依賴前列腺癌細胞亞系PC3Ⅱ[A];華東六省一市泌尿外科學(xué)術(shù)年會暨2011年浙江省泌尿外科、男科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2011年

2 王平;;恢復(fù)人類前列腺癌PC3細胞中Nkx3.1表達提高17β雌二醇的抗腫瘤作用[A];第十五屆全國泌尿外科學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

3 陳穎麗;李前忠;;不同亞細胞位置的細胞凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性分析[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

4 孫英麗;趙允;朱山;翟中和;;植物細胞凋亡及其機理的研究[A];中國細胞生物學(xué)學(xué)會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

5 劉二龍;袁慧;;鋅與細胞凋亡[A];2003全國家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文專輯[C];2003年

6 邱潔;高海青;;鋅在細胞凋亡中的作用研究進展[A];山東省微量元素科學(xué)研究會第三屆學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2006年

7 俞雅萍;;細胞凋亡的機制及途徑和影響因素[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

8 于青;袁偉杰;姚建;;晚期糖基化終末產(chǎn)物引起足細胞凋亡的機制[A];2007年浙滬兩地腎臟病學(xué)術(shù)年會資料匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 商東;“細胞凋亡”與臨床醫(yī)學(xué)[N];中國醫(yī)藥報;2001年

2 張志軍;細胞凋亡與中醫(yī)藥[N];中國醫(yī)藥報;2002年

3 ;“細胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳軍;p27抑制激素抵抗前列腺癌PC3細胞株表皮生長因子受體（EGFR）的研究[D];浙江大學(xué);2007年

2 黃玉華;siRNA沉默HIF-1α基因?qū)η傲邢侔㏄C3細胞生物學(xué)行為及多西紫杉醇化療和放療敏感性的影響[D];蘇州大學(xué);2010年

3 楊利;系列多氮類化合物的抗腫瘤活性研究[D];武漢大學(xué);2012年

4 張浩;從分子、細胞和動物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細胞凋亡的效應(yīng)與機理[D];山東大學(xué);2015年

5 何欣怡;家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）抑制家蠶BmN細胞凋亡的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

6 馮全服;從線粒體途徑研究川芎嗪誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡效應(yīng)機制[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 張曉倩;高糖誘導(dǎo)Bim蛋白高表達而促腎近曲小管上皮細胞凋亡的機制探討[D];山東大學(xué);2015年

8 孫健瑋;PTEN基因負調(diào)控Raf1磷酸化的作用及其對PC3細胞凋亡的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

9 徐林艷;腫瘤細胞凋亡過程中TNFRSF10B和CFLAR調(diào)控機制研究[D];山東大學(xué);2015年

10 樊慶端;生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建模與動力學(xué)行為研究[D];上海大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 朱曉霜;DAB2IP在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌PC3細胞生物學(xué)特性影響的研究[D];暨南大學(xué);2015年

2 任麗芬;TFDP3對前列腺癌LNCaP細胞自噬及凋亡調(diào)控的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

3 李琦;HnRNPL對前列腺癌PC3細胞的功能及生長調(diào)控機制的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

4 齊瑞芳;姜黃素聯(lián)合紫杉醇對前列腺癌PC3細胞增殖和侵襲的體內(nèi)外影響[D];青島大學(xué);2009年

5 王曉春;硫氧還蛋白反義寡核苷酸對前列腺癌PC3細胞生物學(xué)特性的影響[D];蘇州大學(xué);2005年

6 趙輝;姜黃素和紫杉醇聯(lián)用對前列腺癌PC3移植瘤的抑制作用[D];青島大學(xué);2010年

7 許愛輝;新型蛋白酶體抑制劑地錢素M誘導(dǎo)前列腺癌PC3細胞凋亡的研究[D];山東大學(xué);2010年

8 熊永江;低劑量砷聯(lián)合Cyclopamine協(xié)同抑制非雄激素依賴的前列腺癌PC3細胞生長的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年

9 林云知;喹啉衍生物作用前列腺癌PC3細胞縫隙連接來影響順鉑化療敏感性[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

10 王密;E2F3基因沉默對前列腺癌PC3細胞系細胞周期和細胞凋亡的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2237944