研究背景:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性發(fā)病人數(shù)第二、死亡人數(shù)第五的腫瘤,其嚴(yán)重威脅著中老年男性的生活健康。在美國(guó),前列腺癌是男性發(fā)病率第一、死亡率僅次于肺癌的腫瘤。前列腺癌的發(fā)病率有著明顯的地理差異,在中國(guó),由于人們物質(zhì)生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變等等,前列腺癌的發(fā)病率雖然遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的水平,但增長(zhǎng)速度越來(lái)越快。1998~2008年,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率年均增加比例約為12.07%,是男性增長(zhǎng)率最快的腫瘤。雄激素剝奪治療(ADT)是目前治療晚期前列腺癌病人最有效的方法,但是這些病人最終都會(huì)不可避免的進(jìn)展到去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)階段。盡管目前有多種治療方式在嘗試解決這個(gè)問(wèn)題,如化療(多西他賽、卡巴他塞)、放療、新型研發(fā)的雄激素受體(AR)通路抑制劑(恩雜魯胺、阿比特龍)、Ra-223以及仍處于試驗(yàn)階段的PARP抑制劑奧拉帕尼等等,無(wú)一例外都難以徹底逆轉(zhuǎn)CRPC的進(jìn)展,因此需要更多的研究去弄清這些治療藥物的耐藥機(jī)制,或者亟需更多新興的藥物研發(fā)以治療CRPC患者。值得注意的是,目前大部分研究都只關(guān)注腫瘤細(xì)胞本身,而對(duì)其賴以生存的周圍環(huán)境卻研究較少。但我們知道,腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開其周圍的環(huán)境�！胺N子土壤”學(xué)說(shuō)指出,“種子”和它周圍的“土壤”共同構(gòu)成了腫瘤發(fā)生發(fā)展的因素。因此,對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō),其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程都是與其周圍環(huán)境密不可分的,我們應(yīng)該將腫瘤及其微環(huán)境作為一個(gè)整體進(jìn)行研究,這樣也許就能解決目前的困境。腫瘤微環(huán)境中包括微血管、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等,還包括各種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、趨化因子、化學(xué)因子等,它們共同形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。而這其中,免疫細(xì)胞在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中起了至關(guān)重要的作用。針對(duì)CTLA4或者PD1/PDL1的抗體已經(jīng)在包括腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌等多個(gè)腫瘤中證實(shí)有效。這說(shuō)明針對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行靶向治療的策略切實(shí)可行。但是在前列腺癌中,傳統(tǒng)的免疫治療似乎對(duì)這兩種免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效果并不明顯。因此就需要我們?nèi)ふ夷退帣C(jī)制,并進(jìn)一步探索新的免疫治療方法。研究目的:本課題旨在探索晚期前列腺癌耐藥機(jī)制與周圍免疫微環(huán)境之間的關(guān)系和相互作用機(jī)制,主要分為以下三個(gè)部分:首先,從恩雜魯胺耐藥的晚期前列腺癌患者出發(fā),探索其周圍免疫微環(huán)境細(xì)胞,即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)與腫瘤細(xì)胞之間的作用關(guān)系。其次,探索腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)與腫瘤細(xì)胞的具體作用機(jī)制。最后,將晚期前列腺癌患者與其周圍的免疫微環(huán)境作為一個(gè)整體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)并比較CRPC進(jìn)展過(guò)程中前列腺癌組織微環(huán)境中免疫細(xì)胞的整體分布情況,繪制免疫圖譜。對(duì)CRPC組織免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞Bulk測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)的分子水平變化,尋找合適的干預(yù)靶點(diǎn),設(shè)計(jì)小分子藥物和單克隆抗體,探索用于臨床治療的可能。研究方法:本課題前兩部分的研究,首先通過(guò)免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)了TAMs與晚期耐藥前列腺癌患者的關(guān)系,并驗(yàn)證了140例臨床患者的基本資料,緊接著通過(guò)體外建立共培養(yǎng)細(xì)胞系,即單核巨噬細(xì)胞系與前列腺癌耐藥細(xì)胞系之間的共培養(yǎng)體系,研究TAM與前列腺腫瘤細(xì)胞之間的作用關(guān)系和機(jī)制。還通過(guò)Western Blot,qPCR,免疫共沉淀IP,染色質(zhì)免疫共沉淀CHIP等蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法確定了兩者在轉(zhuǎn)錄層面和表達(dá)層面之間的分子變化。此外,我們用抗體芯片確定了TAMs分泌IL6來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制,并用ELISA等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。除此之外,在確定關(guān)鍵的作用機(jī)制靶點(diǎn)之后,我們構(gòu)建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐藥模型,在小鼠體內(nèi),針對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的藥物以及治療手段進(jìn)行試驗(yàn)。在第三部分的研究中,我們對(duì)早期前列腺癌和晚期前列腺癌組織應(yīng)用CyTOF技術(shù),發(fā)現(xiàn)了其免疫微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞的變化情況,并根據(jù)某些功能分子進(jìn)行分群。針對(duì)其主要免疫反應(yīng)的T細(xì)胞,我們將其分離提純,并進(jìn)行了Bulk測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了其轉(zhuǎn)錄組的詳細(xì)改變,由此發(fā)現(xiàn)了NRP1這個(gè)關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)。并找到了它的作用配體,即腫瘤細(xì)胞分泌的SEMA3A,并通過(guò)一系列針對(duì)于T細(xì)胞的增殖、分泌實(shí)驗(yàn),在體外水平驗(yàn)證了它能夠通過(guò)NRP1發(fā)揮抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用。研究結(jié)果:首先,我們通過(guò)免疫組化和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法發(fā)現(xiàn)了,腫瘤周圍的TAMs與ADT誘導(dǎo)的前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化呈正相關(guān)。并且這兩者的關(guān)系和患者臨床資料的預(yù)后、生化復(fù)發(fā)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)意義。其次,我們通過(guò)建立共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)了耐藥的前列腺癌細(xì)胞能夠募集并極化TAMs。更有趣的是,募集并極化的TAMs也能夠進(jìn)一步導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的耐藥和神經(jīng)內(nèi)分泌分化。緊接著,我們通過(guò)抗體芯片的方式找到了TAMs是通過(guò)分泌IL6/STAT3通路來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的耐藥特性的。而具有恩雜魯胺耐藥特性的前列腺癌細(xì)胞則是通過(guò)擴(kuò)增和分泌HMGB1來(lái)影響TAMs,即HMGB1不僅能夠穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin不被降解,使其順利入核激活下游神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,而且能夠分泌入細(xì)胞間隙,通過(guò)旁分泌的方式作用于單核巨噬細(xì)胞,募集并使其極化為TAMs,從而使TAMs又分泌更多的IL6去影響腫瘤細(xì)胞,由此形成了一個(gè)正反饋環(huán)路,導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的耐藥性。接下來(lái),我們構(gòu)建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐藥模型,將針對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的藥物即針對(duì)HMGB1和IL6R的藥物,將其應(yīng)用于小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)不管是單用任何一種藥物,較安慰劑組相比,都能夠顯著改善其耐藥的特性,兩者聯(lián)合使用效果更佳。最后,我們將研究重點(diǎn)擴(kuò)展到了整個(gè)晚期前列腺癌的免疫微環(huán)境,通過(guò)CyTOF技術(shù)發(fā)現(xiàn)晚期去勢(shì)抵抗性前列腺癌CRPC患者的免疫微環(huán)境較早期改變顯著,繪制了兩者的免疫圖譜差異,并詳細(xì)比較了包括CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、MDSC細(xì)胞、DC細(xì)胞等在內(nèi)的各種免疫細(xì)胞的改變差異,我們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞在免疫微環(huán)境中的改變尤其重要。因此我們將腫瘤組織中的T細(xì)胞進(jìn)行了Bulk測(cè)序,找出了T細(xì)胞功能改變的關(guān)鍵分子NRP1,并通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了其作用配體SEMA3A,證實(shí)SEMA3A是通過(guò)作用于T細(xì)胞表面的NRP1最終導(dǎo)致T細(xì)胞增殖能力降低、分泌功能下降、發(fā)揮免疫功能的能力喪失,從而產(chǎn)生免疫逃逸的機(jī)制。研究結(jié)論:本研究從TAMs與晚期耐藥腫瘤細(xì)胞的互相作用關(guān)系著手,發(fā)現(xiàn)了腫瘤周圍免疫微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)展、耐藥的影響,并且發(fā)現(xiàn)了晚期前列腺癌中,其耐藥的細(xì)胞系通過(guò)HMGB1的自分泌與旁分泌功能募集、趨化單核巨噬細(xì)胞,TAMs形成后分泌IL6/STATA3通路反過(guò)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥的環(huán)路。除此之外,還將晚期前列腺癌與早期前列腺癌的的整個(gè)免疫微環(huán)境繪制出了一張清晰的圖譜,而且對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)了其中重要的抑制免疫反應(yīng)的一條通路,為新的免疫治療策略奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ),為晚期耐藥前列腺癌患者提供了新的希望。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：
志物 NSE 和 CHGA 相比之下也偏高，如圖 1-1 C,D 及 1-2C,D 所示。除此之外，我們比較了 CRPC 組織中 CD163 表達(dá)量在陰性表達(dá)及高表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物中的差異，發(fā)現(xiàn)在 CRPC 中，CD163 在高表達(dá) NE 標(biāo)志物的組織里表達(dá)量較高，如圖 1-1 E,F 及 1-2 E,F 所示。因此，這些數(shù)據(jù)暗示在前列腺癌中TAMs 與 ADT 誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌分化有正性相關(guān)的關(guān)系。
圖 1-2 前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物在疾病不同狀態(tài)的差異統(tǒng)計(jì)分析表 1-1 經(jīng)過(guò) ADT 治療后轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者的基本資料o. Aget-PSA(ng/ml)Metastatic site SVI PNIPre-GSMedication Post-GSDuratio(months1 70 151 lymph node, bone N Y 4+5=9LeuprorelinAcetate andBicalutamide4+5=9 42 57 76.1 bone N N 5+4=9 3+4=7 63 82 10.6 lymph node N N 5+5=10 5+5=10 144 67 88 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 5.55 81 1459 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 6除此之外，我們還檢測(cè)了 CD163 與 NSE 或者 CHGA 的這種共表達(dá)關(guān)系是否與前列腺癌患者的臨床預(yù)后有關(guān)。如圖 1-3 及表 1-2 及表 1-3 所示，共有 140 個(gè)患者被分成了四組，我們同時(shí)檢測(cè)了 CD163 與 NSE 或者 CHGA 它們的表達(dá)量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者的共表達(dá)與預(yù) Gleason 評(píng)分，腫瘤分期，膜侵襲狀態(tài)，手
圖 1-3 CD163 與 NSE 標(biāo)志物跟前列腺癌臨床特征之間的關(guān)系除此之外，我們還在小鼠動(dòng)物模型中驗(yàn)證了這一結(jié)果。如圖 1-4 所示，我們將帶有熒光基團(tuán)的 C4-2 細(xì)胞系注射進(jìn)小鼠的前列腺中，第四周后對(duì)小鼠進(jìn)行手術(shù)去勢(shì)，與此同時(shí)服用恩雜魯胺藥物，以后每周通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)腫瘤體積變化以及血漿 PSA 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最開始 PSA 水平是下降的，而且腫瘤的生長(zhǎng)速度也變慢了，但是在晚期，PSA 水平和腫瘤的生長(zhǎng)速度都升高了，這說(shuō)明小鼠原位移植經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間 ADT 治療后，恩雜魯胺耐藥了。而且，我們檢測(cè)了小鼠組織中 F4/80，NSE 以及 CHGA 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們都比對(duì)照組的表達(dá)量升高。這些結(jié)果說(shuō)明，ADT 誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌分化不僅是前列腺癌 ADT 治療抗性的原因之一，同時(shí)它的發(fā)生也和 TAM 的浸潤(rùn)密切相關(guān)。
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本文編號(hào)：
2874598
