CUL4B 是 Cullin 4B-Ring E3 泛素連接酶(Cullin 4B-Ring ubiquitin ligases,CRL4B)的骨架蛋白,CRL4B可以通過泛素化修飾調(diào)控多種重要底物蛋白,參與調(diào)控細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù),信號傳導(dǎo)等重要生理過程。我們前期研究表明,CUL4B還可以通過催化H2AK119單泛素化,招募多梳抑制復(fù)合物(Polycomb-repressive complex 2,PRC2),參與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們對CUL4B在不同實體腫瘤中的表達情況及相關(guān)分子機制進行了一系列研究,結(jié)果顯示,CUL4B在肝細(xì)胞性肝癌高表達,通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進肝細(xì)胞性肝癌的增殖和遷移;在胃癌組織中CUL4B可上調(diào)HER2表達促進胃癌細(xì)胞浸潤和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT);在前列腺癌(prostate cancer,PCa)中,CUL4B 與 SOX4 形成正向調(diào)控反饋環(huán)路,促進前列腺癌細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移;在膽管細(xì)胞癌中,CUL4B抑制抑癌基因P16和磷酸酶與張力蛋白同源物表達,促進腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及EMT。CUL4B在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)分子機制研究處于起步階段,仍需進一步探索。C-MYC作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在前列腺上皮內(nèi)瘤變(prostatic intraepithelial neoplasia,PIN)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用并參與維持前列腺癌干細(xì)胞特征,在腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等各方面起著重要作用。研究表明,C-MYC促進雄激素受體(androgen receptor,AR)的轉(zhuǎn)錄,可作為去勢抵抗性前列腺癌患者AR定向治療的輔助治療靶點。C-MYC蛋白水平因受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后及翻譯后表觀調(diào)控的影響,與其mRNA表達并不一致。在前列腺癌中關(guān)于C-MYC蛋白表達的表觀遺傳調(diào)控機制是目前研究熱點之一。MicroRNAs(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,在胞質(zhì)中miRNA可以通過堿基互補配對原則,引導(dǎo)Argonaute(AGO)蛋白與靶mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'UTR)結(jié)合,介導(dǎo)基因沉默,屬于轉(zhuǎn)錄后表觀調(diào)控。研究顯示,miRNAs在多種人類惡性腫瘤中表達失調(diào),在惡性腫瘤細(xì)胞獲取持續(xù)的增殖信號、逃避生長抑制、抗凋亡、促進永生化、誘導(dǎo)血管生成及促進浸潤和轉(zhuǎn)移等方面均發(fā)揮重要作用。鑒于C-MYC在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,本研究探討了在前列腺癌中CUL4B對C-MYC的調(diào)控作用,并從miRNAs的表觀遺傳學(xué)調(diào)控角度分析了其調(diào)控的相關(guān)分子機制。第一部分CUL4B在前列腺癌中高表達并與不良預(yù)后有關(guān)前列腺癌是美英等西方國家男性最常見的惡性腫瘤,在我國發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢,且多數(shù)患者就診時已是中晚期,是影響男性生命健康的常見腫瘤之一。我們前期研究顯示,CUL4B在肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌等多種實體腫瘤中高表達,在部分腫瘤中與臨床病理參數(shù)具有關(guān)聯(lián)性。CUL4B在前列腺癌中的表達及與預(yù)后的相關(guān)性研究方面目前取得以下成果:1.CUL4B在前列腺癌組織中表達上調(diào)并與Gleason評分相關(guān):免疫組織化學(xué)染色方法顯示,CUL4B在前列腺癌組織中的表達較良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)組織明顯上調(diào)(P0.001),CUL4B 高表達與不同Gleason評分具有相關(guān)性(P=0.03)。2.公共生物信息數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)中的數(shù)據(jù)分析提示CUL4B的表達和不良臨床預(yù)后相關(guān):公共數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)分析結(jié)果顯示,與癌周良性前列腺組織相比,CUL4B mRNA水平在前列腺癌組織中表達顯著上調(diào);在轉(zhuǎn)移瘤中表達高于原發(fā)灶;CUL4B過表達與Gleason評分、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生化復(fù)發(fā)相關(guān)。第二部分CUL4B轉(zhuǎn)錄后調(diào)控前列腺癌C-MYC蛋白水平本部分研究中,我們利用細(xì)胞實驗及臨床病例組織,在mRNA和蛋白水平上探討了 CUL4B對C-MYC的調(diào)控關(guān)系,目前取得以下研究成果:1.CUL4B正向調(diào)控C-MYC蛋白表達:Western blot顯示C-MYC蛋白在CUL4B siRNA敲減的PC3細(xì)胞中表達顯著降低,在Flag4B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CUL4B過表達的22RV1細(xì)胞中顯著上調(diào)。而在C-MYC mRNA siRNA干擾后,CUL4B蛋白表達并沒有產(chǎn)生變化。這一結(jié)果提示CUL4B是C-MYC蛋白的正向調(diào)控因子,屬單向調(diào)控。IHC顯示,在前列腺癌組織中CUL4B與C-MYC蛋白表達水平高度相關(guān)(P=0.0014)。2.CUL4B表達異常不影響C-MYC mRNA表達:RT-qPCR檢測顯示,在PC3細(xì)胞CUL4B siRNA干擾后,或在22RV1細(xì)胞Flag4B過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,C-MYC mRNA沒有發(fā)生顯著變化。提示在前列腺癌中CUL4B對C-MYC蛋白的正向調(diào)控屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。第三部分CUL4B-miR-33b-5p-C-MYC軸促進前列腺癌的進展鑒于CUL4B對C-MYC的調(diào)控關(guān)系為轉(zhuǎn)錄后正向調(diào)控,我們推測CUL4B對C-MYC的調(diào)控可能通過miRNAs的介導(dǎo)作用實現(xiàn)。本部分研究對CUL4B促進前列腺癌的發(fā)生和進展相關(guān)分子機制提供了新的切入點。1.CUL4B轉(zhuǎn)錄抑制miR-33b的表達:我們提取PC3細(xì)胞CUL4B siRNA干擾后總RNAs,進行miRNA芯片分析,鑒定了 CUL4B調(diào)控的miRNAs譜系。接下來采用生物信息學(xué)技術(shù),獲取靶向C-MYC的miRNAs數(shù)據(jù)集,并與siCUL4B敲減后上調(diào)2倍及以上的miRNAs取交集。結(jié)果顯示,miR-33b滿足上述條件,且TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本分析顯示,miR-33b-5p在前列腺癌中表達較正常前列腺組織降低。因此,miR-33b-5p成為我們下一步實驗的靶點。RT-qPCR檢測表明,在PC3細(xì)胞siCUL4B干擾組pri-miR-33和miR-33b-5p表達水平均升高,在22RV1細(xì)胞CUL4B過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組pri-miR-33和miR-33b-5p表達水平均降低。ChIP檢驗表明CUL4B可結(jié)合到miR-33啟動子區(qū)。上述結(jié)果提示,CUL4B在轉(zhuǎn)錄水平上抑制miR-33b表達。2.miR-33b-5p直接靶向C-MYC:雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測顯示miR-33b-5p過表達顯著抑制pmiR-GLO-C-MYC 3'UTR-Wt熒光素酶活性,而共轉(zhuǎn)染 miR-33b-5 mimcs 和 pmiR-GLO-C-MYC 3'UTR-Mut 質(zhì)粒,熒光素酶活性未見明顯變化。Western blot檢測表明,在PC3和22RV1細(xì)胞中過表達miR-33b可顯著降低C-MYC的表達水平;而抑制miR-33b的表達,C-MYC表達水平上調(diào)。拯救實驗顯示,在22RV1細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Flag4B/Flagα及miR-33b mimics/NC后,miR-33b mimics部分抑制了 C-MYC的過表達,在PC3細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 siCUL4B/siNC 及 miR-33b inhibitor/inhibitor NC 后,miR-33b inhibitor部分逆轉(zhuǎn)了對C-MYC表達的抑制作用。3.miR-33b-5p抑制CUL4B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞增殖:克隆試驗、MTS實驗及EdU實驗表明,CUL4B可顯著促進22RV1細(xì)胞的增殖能力,而共轉(zhuǎn)染miR-33b-5p mimics/NC及Flag4B過表達質(zhì)粒后,這一作用被部分抑制。4.miR-33b-5p抑制CUL4B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移浸潤:劃痕實驗和transwell實驗表明,CUL4B過表達可顯著增強22RV1細(xì)胞遷移和侵襲能力,miR-33b-5p mimics可部分逆轉(zhuǎn)CUL4B的上述作用。5.miR-33b-5p抑制CUL4B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)分子表達:流式細(xì)胞儀分選實驗統(tǒng)計結(jié)果表明,與陰性對照組比較,CUL4B過表達的22RV1細(xì)胞CD133+細(xì)胞數(shù)明顯增多,而Flag4B+mimics組較陰性對照組比較降低了陽性細(xì)胞百分比。Western blot顯示CUL4B過表達可上調(diào)CD133、CD44、Nanog、BMI蛋白的表達,而共轉(zhuǎn)染miR-33b-5p mimics后,增強表達的效果明顯減弱。綜上所述,CUL4B在前列腺癌中高表達,可通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-33b-5p正向調(diào)控C-MYC的表達,是促進前列腺癌增殖和進展的重要癌基因。miR-33b-5p可部分逆轉(zhuǎn)CUL4B誘導(dǎo)的前列腺癌增殖、遷移浸潤和干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物的表達。我們的研究闡述了 CUL4B促進前列腺癌發(fā)生和進展的相關(guān)分子機制,為前列腺癌的靶向治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：
細(xì)胞核著色，而在前列腺癌組織中，ＣＵＬ４Ｂ為腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核著色；在ＢＰＨ??組織中ＣＵＬ４Ｂ陽性率（中等陽性和強陽性）僅為１．６％，大部分為弱陽性表達，??而前列腺癌中陽性表達率達２７％?（圖１），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（尸＜０．００１）。??ＨＥ?ＣＵＬ４ＢＩＨＣ??ｋｍ?；＿釋＿??．?：??圖１?ＣＵＬ４Ｂ在前列腺癌組織表達上調(diào)。（Ａ）?ＢＰＨ組織，ＨＥ染色，４００Ｘ。（Ｂ）??ＣＵＬ４Ｂ在ＢＰＨ中的表達，與Ａ為同一組織，ＩＨＣ，?４００Ｘ。（Ｃ）?ＰＣａ組織，ＨＥ??染色，４００Ｘ。（Ｄ）?ＣＵＬ４Ｂ在ＰＣａ中的表達，與Ｃ為同一組織，ＩＨＣ，?４００Ｘ。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?ＣＵＬ４Ｂ?ｗａｓ?ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｐｒｏｓｔａｔｅ?ｃａｎｃｅｒ．?（Ａ）?ＢＰＨ?ｔｉｓｓｕｅ，?ＨＥ??ｓｔａｉｎｉｎｇ，?４００?Ｘ．?（Ｂ）?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ＢＰＨ，?ｔｈｅ?ｓａｍｅ?ｔｉｓｓｕｅ?ａｓ?Ａ，?ＩＨＣ，??４００?Ｘ．?（Ｃ）?ＰＣａ?ｔｉｓｓｕｅ，?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ，?４００?Ｘ．?（Ｄ）?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ＰＣａ，??ｔｈｅ?ｓａｍｅ?ｔｉｓｓｕｅ?ａｓ?Ｃ，?ＩＨＣ，?４００?Ｘ．??Ｇｌｅａｓｏｎ評分系統(tǒng)與前列腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后關(guān)聯(lián)密切
?解ＣＵＬ４Ｂ在前列腺癌中的生物學(xué)行為，我們同時觀察了?ＣＵＬ４Ｂ在不同??Ｇｌｅａｓｏｎ評分中的表達情況（圖２）。結(jié)果如表１所不，ＣＵＬ４Ｂ在Ｇｌｅａｓｏｎ評分＞７??的病例較￥７的病例中表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＝０．０３）。??－…一?一Ａ?夕７：：．?Ｂ??一？一ｒ?７?＾?．?ｙ?？?〈入??〈乂－．?—ｙ人ｖ?，ｗ?ｗ％?ｕ??動＿??ｆ?Ｉｆ．編１１麟禮Ｉ??圖２?ＣＵＬ４Ｂ在不同Ｇｌｅａｓｏｎ評分的前列腺癌組織中的表達。ＣＵＬ４Ｂ染色強度分為陰??性（Ａ，Ｇｌｅａｓｏｎ?評分?３＋３＝６）、弱陽性（Ｂ，Ｇｌｅａｓｏｎ?評分?３＋４＝７）、中等陽性（Ｃ，Ｇｌｅａｓｏｎ??評分?４＋４＝８）和強陽性（Ｄ，Ｇｌｅａｓｏｎ?評分?５＋４＝９），?ＩＨＣ，?４００Ｘ。??Ｆｉｇｕｒｅ?２?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ｐｒｏｓｔａｔｅ?ｃａｎｃｅｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｗｉｔｈ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?Ｇｌｅａｓｏｎ??ｓｃｏｒｅｓ．?ＣＵＬ４Ｂ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ?ｗａｓ?ｄｉｖｉｄｅｄ?ｉｎｔｏ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?（Ａ，?Ｇｌｅａｓｏｎ?ｓｃｏｒｅ?３＋３＝６），??ｗｅａｋ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?（Ｂ，?Ｇｌｅａｓｏｎ?ｓｃｏｒｅ?３＋４＝７），?ｍｅｄｉｕｍ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?（Ｃ，?Ｇｌｅａｓｏｎ?ｓｃｏｒｅ?４＋４＝８）?ａｎｄ??ｓｔｒｏｎｇ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?（Ｄ
??水平在前列腺癌中增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（尸＜?０．０５，圖３Ａ）。ＧＳＥ３２２８９??數(shù)據(jù)分析顯示，在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移樣本中ＣＵＬ４Ｂ?ｍＲＮＡ水平較原發(fā)灶中升高??（Ｆ＜?０．０１，圖?３Ｂ）。接下來我們對?Ｃａｎｃｅｒ?Ｇｅｎｏｍｅ?Ａｔｌａｓ?（ＴＣＧＡ）前歹ｉｊ腺癌??大數(shù)據(jù)進一步分析，在對不同前列腺癌Ｇｌｅａｓｏｎ評分分析中，７分病例中??ＣＵＬ４Ｂ?ｍＲＮＡ相對水平高于６分（尸＜０．０５），?Ｇｌｅａｓｏｎ評分８－１０分的病例中??ＣＵＬ４Ｂ?ｍＲＮＡ水平顯著高于７分，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（尸＜０．０１）；對病理??分期的分析顯示，隨著腫瘤體積的不斷增加，ＣＵＬ４Ｂ?ｍＲＮＡ的表達水平亦不??斷提高（＾＝０．０００１）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者樣本中的ＣＵＬ４Ｂ??ｍＲＮＡ相對水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組（／＾〈Ｏ．ＯＯＯＤＣ圖３Ｃ）；此外，在生化??復(fù)發(fā)病例中ＣＵＬ４Ｂ?ｍＲＮＡ水平較未出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)組顯著升高（圖３Ｄ）。??２１??
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本文編號：
2876499
