發(fā)布時間：2018-12-30 14:09

【摘要】：背景腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育及功能維持中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),除神經(jīng)系統(tǒng)外,許多外周組織亦可合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF,比如腸粘膜上皮細胞、血管內皮細胞以及牙周組織。一些研究表明,周圍神經(jīng)細胞分泌多種可溶性因子如BDNF、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial-derived neurotrophic factor, GDNF),這些因子在維持血神經(jīng)屏障的完整性或者通透性以及調控緊密連接因子上發(fā)揮著重要作用；在胎兒發(fā)育過程中,血管內皮細胞合成并分泌的BDNF因子,通過其高親和力受體酪氨酸激酶B (tyrosine kinase B, TrkB),發(fā)揮調節(jié)血管內皮屏障的功能；細胞實驗中,在炎癥因子刺激下,人微血管內皮細胞分泌較多BDNF因子,BDNF通過促進血管內皮鈣黏著蛋白的表達來抑制血管內皮屏障功能的失調。鈣黏著蛋白是細胞間連接蛋白的重要成員之一,在調控內皮細胞屏障的通透性中發(fā)揮著至關重要的作用。在消化系統(tǒng)中,神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員NGF與神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophins-3, NT-3)均參與腸道屏障功能的調控。已有研究表明BDNF在結腸粘膜中表達豐富,然而BDNF是否參與調控腸上皮屏障功能目前尚未見文獻報道。目的1.運用基因敲除小鼠模型探討B(tài)DNF在結腸上皮屏障的生理作用；2.運用基因敲除小鼠模型探討B(tài)DNF對結腸上皮細胞凋亡以及緊密連接蛋白(tight j unction proteins, TJs)的影響；研究參與BDNF+/-小鼠結腸上皮細胞凋亡的相關因子；3.應用小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)下調結腸上皮細胞ht-29中BDNF的表達并研究其對TJs的影響。4.探討B(tài)DNF因子對ht-29結腸上皮細胞TJs的直接影響。方法1.動物試驗取健康野生型C5781/6小鼠(BDNF+/+)與基因敲除BDNF+/-小鼠結腸粘膜標本,運用尤斯灌流技術檢測結腸粘膜電阻值(transepithelial resistance, TER),評估結腸粘膜完整性；用蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色以及透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察結腸粘膜上皮的結構；利用末端標記法(TUNEL)染色、active-caspase-3染色以及免疫印跡法測定active-caspase-3、bcl-2和bax含量評估凋亡情況；利用免疫組化技術檢測TJs (occludin與ZO-1)在結腸粘膜的表達與分布,利用免疫印跡法測定TJs (claudin-1與claudin-2)在結腸粘膜的表達。2.細胞試驗以人結腸上皮細胞系ht-29為研究對象,設計合成針對BDNF的小干擾RNA,將BDNF-siRNA轉染入結腸上皮細胞作為實驗組,無活性的siRNA轉染作為對照組,實時熒光定量RT-PCR和免疫印跡法檢測各組結腸上皮細胞中BDNF和TJs(occludin、 ZO-1、claudin-2和claudin-1)基因與蛋白表達水平的變化。為了研究BDNF在結腸上皮細胞的直接作用,分別用1ng/m、10ng/ml、100ng/ml BDNF刺激細胞,選取2h、6h、12h、24h獲取細胞后,應用實時熒光定量RT-PCR和免疫印跡法檢測各實驗組結腸上皮細胞TJs (occludin、ZO-1、claudin-2和claudin-1)基因與蛋白表達的變化。3.統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件,計量資料以均值±標準誤表示。兩組之間的比較的比較均采用獨立樣本t檢驗方法；對于BDNF因子對結腸上皮細胞TJs基因與蛋白的影響,采用單因素方差的Dunnett't分析。P值小于0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.動物試驗與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/小鼠結腸上皮屏障破壞,結腸粘膜超微結構異常,表現(xiàn)為微絨毛缺失、線粒體腫脹、細胞間隙增寬、細胞凋亡增加以及細菌入侵；TUNEL陽性結腸上皮細胞增多以及caspase活性升高證明了BDNF+/-小鼠結腸粘膜中上皮細胞凋亡明顯增多,并且過多的凋亡細胞與BDNF+/-小鼠結腸上皮屏障功能改變存在一定的關聯(lián)。除此之外,BDNF+/小鼠結腸粘膜抑制凋亡bcl-2蛋白表達下調,而促凋亡bax蛋白表達上調。另外,BDNF+/-小鼠結腸上皮細胞緊密連接蛋白occludin、ZO-1以及claudin-1表達下調,而claudin-2表達上調。2.細胞試驗向結腸上皮細胞ht-29轉染siRNA后可以顯著降低BDNF基因與蛋白表達,同時也下調緊密連接蛋白的表達。利用不同濃度的BDNF因子刺激ht-29細胞,可導致緊密連接蛋白(occludin, ZO-1與claudin-1)表達下調,而緊密連接蛋白claudin-2表達上調。結論1.與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠結腸上皮屏障破壞伴隨著緊密連接蛋白異常以及細胞凋亡增多。2.通過上調或者下調結腸上皮細胞中BDNF因子的含量,其緊密連接蛋白表達發(fā)生相應的改變。3.BDNF通過抑制細胞凋亡以及調節(jié)緊密連接蛋白的表達來維持腸道上皮的屏障功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62

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