發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 04:29

【摘要】：目的:HBV的感染一直是困擾人類的一個(gè)問題,現(xiàn)有的手段并不能有效地控制其進(jìn)展,而近年來對RNA干擾的研究證明其在抗病毒方面也有著巨大的潛力。本實(shí)驗(yàn)擬評估長的反義RNA干擾片段在培養(yǎng)細(xì)胞株中對HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)。 方法:(1)將HBV基因組中S編碼基因的全部核苷酸序列插入至pTARGET載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒HBS2(反向插入序列)和HBS4(正向插入序列),并用這兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。(2)實(shí)驗(yàn)分為HBS2組、HBS4組、干擾素組、聚肌胞組和對照組。(3)ELISA法檢測各組細(xì)胞上清中病毒抗原表達(dá)水平。(4)real time PCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)和分泌入培養(yǎng)基的HBV DNA水平及細(xì)胞內(nèi)的HBV cccDNA水平。(5)real time RT-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)β-干擾素mRNA水平。(6)Cellular DNA Fragmentation ELISA測定各組細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果:(1)PCR及測序結(jié)果顯示HBS2和HBS4質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)ELISA結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的水平較對照組降低(P0.05),HBS4組HBsAg水平較對照組升高(P0.05),HBeAg水平無變化(P0.05)。(3)real time PCR結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細(xì)胞上清中HBV DNA水平和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBV cccDNA水平較對照組降低(P0.05),HBS4組則均與對照組無差異(P0.05)。(4)real time RT-PCR結(jié)果顯示HBS2組、聚肌胞組細(xì)胞內(nèi)β-干擾素mRNA水平較對照組升高(P0.05),HBS4組與對照組無差異(P0.05)。(5)Cellular DNA Fragmentation ELISA結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組和聚肌胞組細(xì)胞凋亡率較對照組升高(P0.05),HBS4組與對照組無差異(P0.05)。 結(jié)論:長片段反義RNA能抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV基因的表達(dá)和病毒復(fù)制,且能誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62
【圖文】：

12000rpm 離心 1min，棄去 溶液 W，12000rpm 離心 1min，棄心 3min，以徹底去除純化柱中殘柱置于新的離心管中，向純化柱中 2min。12000rpm 離心 1min。測濃A 為模板，PCR 擴(kuò)增 S 基因的編碼，重組質(zhì)粒經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增后得到陽序后得到重組質(zhì)粒 HBS2 和 HBS S 抗原。質(zhì)粒電泳圖見圖 1-1。1 2 3 4
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2894122